薄荷-山茱萸复方提取物（6:4）通过多靶点途径缓解认知障碍的机制研究

这项研究探讨了薄荷（MP）与山茱萸（CO）按6:4比例（MC）组合的提取物，在体外和体内模型中，如何通过抗氧化、上调脑源性神经营养因子（BDNF）表达、激活下游信号通路（如ERK/AKT/CREB）以及恢复海马乙酰胆碱水平，来发挥神经保护及改善学习记忆功能的作用。其结果表明，MC可作为一种潜在的多靶点治疗策略，用于管理年龄相关的认知能力下降和轻度认知障碍（MCI）。

　　

引言：轻度认知障碍的挑战与植物药复方的潜力

轻度认知障碍（MCI）是介于正常衰老与痴呆之间的中间状态，表现为明显的处理速度、执行控制和记忆功能下降，其向痴呆的年转化率显著高于正常老年人。目前缺乏针对痴呆的疾病修饰疗法，因此在MCI阶段进行干预，稳定或改善认知功能至关重要。MCI的病理机制涉及氧化应激、兴奋性毒性和胆碱能失调等多条通路的汇聚，这些因素会降低脑源性神经营养因子（BDNF）的表达及其下游信号，导致突触功能障碍和神经元丢失。因此，能够同时针对多条通路的策略具有重要研究价值。薄荷（Mentha piperita, MP）和山茱萸（Cornus officinalis, CO）作为传统草药，分别具有抗氧化、抗炎、调节乙酰胆碱酯酶（AChE）以及支持BDNF相关信号通路等互补的神经保护作用。本研究旨在系统评估MP与CO组合提取物（MC）在MCI相关模型中的神经保护作用。

结果

2.1. 高效液相色谱法（HPLC-DAD）鉴定MC标志物化合物

通过高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）分析，确认了组合提取物MC中含有MP的标志物迷迭香酸和CO的标志物山茱萸苷。在MC色谱图中，迷迭香酸和山茱萸苷的保留时间分别为27.3分钟和17.8分钟，与标准品的保留时间和紫外光谱一致。此外，在约15-16分钟处有一个显著峰，通过与标准品比对，被确定为来自山茱萸的莫诺苷。这些结果确立了迷迭香酸和山茱萸苷作为MC质量和批次标准化的定量标志物。

2.2. MP和CO组合提取物减轻H₂O₂诱导的细胞毒性及BDNF下调，6:4比例效果最佳

在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中，使用H₂O₂诱导氧化应激模型。暴露于0.3 mM H₂O₂24小时显著降低了细胞活力和BDNF mRNA水平。用不同比例（6:4， 5:5， 4:6）和浓度（50， 100， 150 μg/mL）的MC预处理1小时后再与H₂O₂共暴露24小时，能显著提高细胞活力。值得注意的是，BDNF mRNA表达的上调具有比例依赖性：6:4的MC组合在50、100和150 μg/mL浓度下均能显著上调BDNF转录水平，而其他比例则未观察到一致性的增加。在150 μg/mL浓度下，6:4 MC配方在提高细胞活力和诱导BDNF mRNA表达方面，均优于单一MP或CO提取物。这表明MP和CO按6:4比例组合在减轻氧化应激诱导的细胞损伤和保护BDNF表达方面最为有效。

2.3. 6:4比例的MP:CO组合减轻H₂O₂诱导的细胞死亡

通过流式细胞术使用膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（PI）染色评估细胞凋亡和坏死。在SK-N-SH细胞中，暴露于0.3 mM H₂O₂24小时显著增加了Annexin V和PI阳性细胞群。用6:4 MP:CO组合处理可减弱H₂O₂诱导的细胞凋亡，在所有测试浓度下均显著减少了早期凋亡和晚期凋亡细胞群。坏死细胞的数量也略有减少。这些发现表明，6:4配方在氧化应激条件下能发挥神经保护作用，包括减少凋亡性细胞死亡。

2.4. 迷迭香酸、山茱萸苷及其组合减轻H₂O₂诱导的细胞毒性和BDNF mRNA下调

进一步评估了标志物化合物迷迭香酸和山茱萸苷单独或组合（6:4， RL）的作用。在细胞活力实验中，迷迭香酸在所有浓度下均能显著提高细胞活力，而山茱萸苷在25、50和100 μM下显著提高细胞活力。值得注意的是，迷迭香酸和山茱萸苷按6:4比例组合处理，在所有浓度下均能显著提高细胞活力。在qRT-PCR分析中，迷迭香酸在所有浓度下均显著增加BDNF mRNA表达水平，而山茱萸苷在25、50和100 μM下显著增加BDNF mRNA水平。6:4 RL组合在所有浓度下均能显著增加BDNF mRNA表达。重要的是，在100 μM浓度下，6:4 RL组合在细胞活力和BDNF mRNA表达方面的改善效果均显著优于单一化合物处理，表明组合成分具有增强效应。

2.5. MC改善了东莨菪碱诱导的记忆障碍（被动回避和莫里斯水迷宫测试）

为了探究体外观察到的神经保护作用是否能转化为体内的认知益处，研究了MC对东莨菪碱诱导的大鼠记忆障碍的影响。七周龄雄性斯普拉格-道利（Sprague-Dawley）大鼠口服MC（50， 100， 200 mg/kg/天）或阳性对照磷脂酰丝氨酸（50 mg/kg/天）28天。在被动回避测试中，与仅接受东莨菪碱的阴性对照组相比，给予MC的大鼠表现出显著增加的步入潜伏期。在莫里斯水迷宫测试中，从训练第4天开始，给予MC的大鼠逃避潜伏期显著缩短。在第5天，所有MC治疗组的逃避潜伏期均显著低于阴性对照组。在探索测试中，MC处理的大鼠在目标象限停留的时间显著长于阴性对照组大鼠，表明空间记忆保留得到改善。同时，东莨菪碱给药显著降低了海马乙酰胆碱水平，而所有MC治疗组和阳性对照组均显示出相对于阴性对照组显著增加的海马乙酰胆碱水平。

2.6. MC通过激活海马BDNF信号通路促进神经保护

通过蛋白质印迹分析探究MC对BDNF及其下游信号通路的影响。东莨菪碱给药显著降低了海马BDNF蛋白水平。阳性对照磷脂酰丝氨酸或MC处理均可恢复BDNF表达，且较高剂量的MC效果更显著。此外，东莨菪碱给药显著降低了细胞外信号调节激酶（ERK）、蛋白激酶B（AKT）和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化水平。磷脂酰丝氨酸和MC治疗均能显著提高ERK、AKT和CREB的磷酸化水平，且MC在较高剂量下显示出更强的促进作用。这些结果表明，MC能够恢复东莨菪碱诱导的BDNF信号通路抑制。

讨论

本研究探讨了按6:4比例组合的薄荷和山茱萸提取物（MC）的神经保护和认知增强作用。MC减轻了活性氧诱导的细胞毒性和细胞凋亡，同时在SK-N-SH细胞中保持了BDNF mRNA的表达。此外，MC改善了大鼠中东莨菪碱诱导的学习和记忆障碍，这伴随着海马乙酰胆碱水平的恢复、BDNF表达的增加以及ERK/AKT/CREB磷酸化的增强。这提示MC可以有效修复轻度认知障碍早期阶段受损的神经营养网络。综合来看，这些结果支持MC作为一种多靶点的植物药策略，作用于与认知能力下降相关的多条汇聚通路。

先前研究表明，迷迭香酸和山茱萸苷是强效抗氧化剂。6:4的MP:CO组合比单一化合物更有效地保护细胞免受氧化损伤，表明其具有更广泛的保护作用。MC在体外实验中持续减轻了氧化应激诱导的损伤并保护了BDNF表达，支持其在活性氧驱动条件下的细胞保护作用。重要的是，在东莨菪碱模型中观察到的行为学改善与海马乙酰胆碱水平的恢复以及BDNF相关信号通路的激活（BDNF和ERK/AKT/CREB）相关，这为将胆碱能恢复和神经营养信号与认知结果联系起来提供了机制基础。

本研究通过HPLC-DAD分析，确认迷迭香酸和山茱萸苷作为MC的标志物化合物，支持提取物的身份和批次一致性。迷迭香酸和山茱萸苷单独及其组合（RL；6:4）均能减轻H₂O₂诱导的细胞活力下降和BDNF mRNA表达下调，支持了其在氧化应激相关细胞条件下的生物学神经保护作用。6:4 RL组合在细胞活力和BDNF mRNA表达方面的保护作用显著优于单独的迷迭香酸或山茱萸苷。同样，与单一MP或CO提取物相比，6:4比例的MP和CO粗提物组合能更有效地减轻H₂O₂诱导的细胞毒性、减少凋亡性细胞死亡，并减轻H₂O₂诱导的BDNF下调，表明优化比例对于最大化互补益处的重要性。

与先前强调薄荷精油的研究不同，本研究突出了富含非挥发性酚类的乙醇MP提取物，作为维持BDNF表达和行为益处的关键贡献者。关于山茱萸，先前研究常将BDNF上调归因于山茱萸苷和莫诺苷等分离的环烯醚萜类化合物。在本研究中，单独的乙醇CO粗提物并未增加BDNF水平。这些差异可能是由于提取溶剂、植物化学成分和剂量的不同所致。值得注意的是，6:4混合物在体外保留了BDNF转录水平，并在体内增加了海马BDNF，同时增强了BDNF相关信号级联下游效应物（包括ERK、AKT和CREB）的磷酸化。两种非排他性机制可能有助于观察到6:4混合物的效果。首先，MP介导的氧化应激条件下的细胞保护和抗凋亡作用，可能建立一个允许的氧化还原环境，从而促进BDNF信号传导。其次，该组合可能作用于汇聚于CREB激活的通路，以维持BDNF表达。

与行为学改善一致，海马分析显示乙酰胆碱水平恢复和BDNF相关信号激活。MC增加了被动回避测试中的步入潜伏期，并减少了莫里斯水迷宫中的逃避潜伏期，且在目标象限停留时间更长，这与依赖于海马可塑性和BDNF-ERK-CREB信号的学习记忆过程改善相符。此外，MC恢复了海马乙酰胆碱水平，支持了胆碱能张力的部分恢复。通过抑制乙酰胆碱酯酶，MC提取物可保持较高的乙酰胆碱水平，并可能阻断继发性氧化应激。这种双重效应解释了为什么MC提取物在经东莨菪碱处理的动物模型中能显著改善记忆和学习能力。

材料与方法

4.1. 提取与样品制备

薄荷和山茱萸粉末及其6:4组合物（MC）从韩国大田的Nine B有限公司获得。MP和CO分别使用30%和20%乙醇提取，这些乙醇浓度是基于工艺优化选择的，以平衡提取率和稳定的喷雾干燥粉末形成。所得提取物经过过滤、真空蒸发和用糊精喷雾干燥。对于比例筛选，MP和CO首先在体外以三种相近的重量比（6:4， 5:5， 4:6）进行测试。基于此筛选，体内实验使用的制剂通过将喷雾干燥的MP和CO粉末以6:4重量比混合制备。

4.2. 高效液相色谱化学分析

使用配备紫外-二极管阵列检测器的Agilent 1260高效液相色谱系统进行分析。色谱分离在Hypersil GOLD C18色谱柱上进行。流动相由0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈组成，梯度洗脱。通过比较特征保留时间和紫外吸收光谱与标准品，鉴定出作为MP和CO标准化合物的迷迭香酸和山茱萸苷。

4.3. 细胞培养与活力测定

SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞在补充了10%胎牛血清和抗生素的DMEM培养基中培养。将细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种在96孔板中。实验组包括：未处理对照组、H₂O₂处理模拟组和预处理组。细胞用提取物或纯化标志物化合物预处理1小时，然后暴露于0.3 mM H₂O₂24小时。使用EZ-Cytox增强型细胞活力检测试剂盒评估细胞活力。

4.4. 定量逆转录聚合酶链反应

使用QIAzol裂解试剂从SK-N-SH细胞中分离总RNA。使用RevertAid H Minus第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green I qPCR试剂盒在CFX Connect实时PCR检测系统上进行qRT-PCR。BDNF mRNA表达水平以GAPDH为内参进行标准化，结果通过2^-ΔΔCt方法计算。

4.5. 基于膜联蛋白V/PI的凋亡细胞死亡测定

使用FACSCalibur流式细胞仪系统评估MC对H₂O₂诱导的SK-N-SH细胞凋亡的影响。细胞用MC预处理1小时后，暴露于0.3 mM H₂O₂24小时。处理后，收集细胞，用FITC标记的膜联蛋白V和PI染色，流式细胞仪分析。

4.6. 东莨菪碱诱导的大鼠记忆障碍模型

七周龄雄性斯普拉格-道利大鼠适应性饲养七天后，随机分为六组，每组5只。MC和阳性对照磷脂酰丝氨酸通过口服灌胃每日一次，连续给药28天。东莨菪碱在行为测试前30分钟腹腔注射。所有动物程序均获得Biotoxtech有限公司机构动物护理和使用委员会的批准。

4.7. 行为学研究

被动回避测试和莫里斯水迷宫测试使用独立的动物队列进行，以避免连续行为测试的潜在混杂效应。

4.7.1. 被动回避测试

使用由光照（白色）和黑暗隔间组成的装置进行测试，中间由一道升降门隔开。在MC给药第25天和第26天进行适应训练。第27天，在口服MC 1小时和腹腔注射东莨菪碱30分钟后，进行习得性训练。24小时后（第28天）进行记忆保持测试，记录步入黑暗隔间的潜伏期。

4.7.2. 莫里斯水迷宫

水迷宫装置由一个圆形水池组成，内有一个隐藏在水面下的平台。经过23天MC治疗后，连续5天（第23-27天）进行水迷宫训练测试。每天，大鼠口服MC后，腹腔注射东莨菪碱，然后进行测试。记录每只大鼠找到平台的逃避潜伏期。第6天（探测试验）移除平台，记录大鼠在60秒内在目标象限停留的时间。

4.8. 乙酰胆碱分析

取部分海马组织，用磷酸盐缓冲盐水匀浆，离心取上清。使用Amplex Red乙酰胆碱/乙酰胆碱酯酶检测试剂盒分析乙酰胆碱水平，用多功能酶标仪记录荧光。

4.9. 蛋白质印迹分析

海马组织在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆。蛋白质样品在SDS上样缓冲液中煮沸，通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。膜用一抗（针对BDNF、总/磷酸化AKT、总/磷酸化ERK、总/磷酸化CREB、β-肌动蛋白）孵育过夜，然后与相应的HRP偶联二抗孵育。使用ECL化学发光底物检测免疫反应条带。

4.10. 统计分析

使用GraphPad Prism 9.0.0软件进行统计分析，数据表示为均值±标准误或均值±标准差。通过Student's t检验评估两组间差异的显著性。p值小于0.05被认为具有统计学意义。所有体外实验均独立重复至少三次以确保可重复性。体内行为学研究中，每组包含5只大鼠。