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本研究首次系统阐明，琥珀酸在细胞外可作为一种新型中枢神经系统损伤相关分子模式（DAMP），通过激活其特异性受体（SUCNR1），对小胶质细胞（中枢神经系统固有免疫细胞）发挥以抗炎为主的免疫调节作用。它不仅能选择性降低促炎因子肿瘤坏死因子-α（TNF）和白细胞介素-6（IL-6）的分泌，减轻其对神经元的毒性，还能抑制过度活化的吞噬功能，并部分恢复脂多糖（LPS）诱导的线粒体呼吸抑制。相比之下，胞内琥珀酸虽可抑制特定细胞因子，却不具备神经保护能力，凸显了琥珀酸作用效应的位置依赖性。这项研究为理解神经免疫稳态及开发针对神经炎症性疾病的治疗策略提供了新视角。
引言：神经炎症、DAMP与琥珀酸的潜在角色
阿尔茨海默病（AD）是痴呆症的首要病因。传统上，细胞外淀粉样蛋白-β（Aβ）沉积形成的斑块和细胞内过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结被认为是AD的主要神经病理学标志。然而，越来越多的证据表明，大脑常驻免疫细胞——小胶质细胞的有害活化，在介导AD中观察到的神经炎症和神经元死亡中起着关键作用。在病理刺激下，稳态的小胶质细胞转变为促炎性的反应性表型，其特征是促炎介质如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF）和白介素-6（IL-6）的分泌上调，以及通过吞噬作用过度清除神经元突触。
损伤相关分子模式（DAMP）是内源性分子，在细胞应激或损伤后释放到细胞外空间，作为强效的免疫刺激信号发挥作用。琥珀酸，一种三羧酸（TCA）循环中间体，是近年来备受关注的潜在DAMP信号分子。在免疫细胞中，缺氧性炎症微环境可导致代谢向糖酵解转变，从而抑制琥珀酸脱氢酶（SDH），导致琥珀酸在细胞内积累。此外，在AD大脑中，由低灌注和线粒体功能障碍等应激因素触发的γ-氨基丁酸（GABA）分流也可能产生过量的琥珀酸。琥珀酸可被质膜二羧酸转运蛋白转运到细胞外，在周围组织中已被认为是一种DAMP，但其在中枢神经系统（CNS）中的具体作用，尤其是其细胞外信号的作用，在很大程度上仍未得到充分探索。本研究旨在探究细胞外琥珀酸作为CNS DAMP的免疫调节作用，并通过比较其与细胞内琥珀酸（分别使用细胞膜不可渗透的琥珀酸二钠和细胞膜可渗透的琥珀酸二乙酯模拟）的效应，揭示其作用的差异性。
材料与方法：细胞模型与功能检测
本研究主要使用BV-2小鼠小胶质细胞系。为了评估细胞外和细胞内琥珀酸的作用，分别使用了细胞膜不可渗透的琥珀酸二钠和可渗透的琥珀酸二乙酯。BV-2细胞在给予不同刺激物（如LPS、干扰素-γ）之前，预先用琥珀酸盐处理，随后评估其多种免疫功能。此外，还使用了人外周血单核细胞（PBMC）作为人类小胶质细胞模型，以研究琥珀酸对线粒体呼吸代谢的影响。
具体检测指标包括：
- 1.
促炎因子分泌：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和Griess实验分别测量细胞培养上清液中TNF、IL-6和亚硝酸盐（NO的稳定分解产物）的浓度。
- 2.
神经毒性：将处理后的BV-2细胞上清液转移到NSC-34小鼠神经元样细胞上，72小时后通过MTT法评估神经元细胞活力，以此反映小胶质细胞分泌物的细胞毒性。
- 3.
吞噬活性：通过测量BV-2细胞摄取荧光乳胶珠的能力来评估其吞噬活性，并使用ImageJ软件量化校正后细胞总荧光（CTCF）。
- 4.
SUCNR1表达：通过数字聚合酶链式反应（PCR）分析BV-2细胞在刺激后Sucnr1基因的表达变化。
- 5.
线粒体呼吸：使用高分辨率呼吸仪测量PBMC的氧气消耗率，评估常规呼吸、复合物I和复合物II支持的氧化磷酸化（OXPHOS）以及最大解偶联呼吸。
- 6.
细胞活力：通过MTT法评估所有处理条件下的细胞活力，确保观察到的效应不是由细胞毒性引起。
结果：细胞外琥珀酸发挥选择性抗炎与神经保护作用
细胞外琥珀酸抑制特定促炎因子分泌
研究首先探究了琥珀酸二钠对BV-2细胞分泌TNF、IL-6和NO的影响。结果发现，琥珀酸二钠在无毒浓度下（最高24毫摩尔）不会诱导未受刺激的BV-2细胞释放这些分子。重要的是，在用LPS和干扰素-γ共同刺激的BV-2细胞中，24毫摩尔的琥珀酸二钠预处理可显著降低TNF和IL-6的分泌水平。当细胞仅用LPS刺激时，也观察到降低趋势，但未达到统计学显著性。有趣的是，琥珀酸二钠对NO的产生没有影响。这表明，细胞外琥珀酸能够选择性地调节BV-2细胞特定促炎因子的产生，而非全面抑制所有炎症介质的释放。
细胞外琥珀酸减轻小胶质细胞介导的神经毒性
接下来，研究评估了琥珀酸二钠对小胶质细胞神经毒性的影响。与预期一致，来自经LPS、干扰素-γ或两者组合刺激的BV-2细胞的上清液，可显著降低NSC-34神经元的存活率。然而，用24毫摩尔琥珀酸二钠预处理BV-2细胞，对所有三种刺激条件均显示出神经保护作用，表现为NSC-34神经元存活率显著提高。在LPS加干扰素-γ刺激条件下，12毫摩尔的琥珀酸二钠也能显著减轻神经毒性。这种神经保护作用并非源于琥珀酸二钠降低了BV-2细胞本身的活力，且处理物质本身对神经元也无直接影响。数字PCR分析进一步证实，BV-2小胶质细胞表达琥珀酸受体Sucnr1，且在LPS加干扰素-γ刺激12小时后，其表达显著上调。这为细胞外琥珀酸通过受体介导发挥作用提供了线索。
胞内琥珀酸抑制细胞因子但不具备神经保护作用
为了探究琥珀酸的作用是否取决于其位置，研究使用了可渗透细胞膜的琥珀酸二乙酯。与琥珀酸二钠类似，琥珀酸二乙酯在无毒浓度下能显著降低LPS或LPS加干扰素-γ刺激的BV-2细胞分泌TNF和IL-6的水平。然而，与琥珀酸二钠的关键差异在于，琥珀酸二乙酯并未减少BV-2小胶质细胞介导的神经毒性，即它未能像琥珀酸二钠那样提高NSC-34神经元的存活率。这一结果突出表明，琥珀酸必须作用于细胞外，才能降低小胶质细胞的总体神经毒性，这反映了神经毒性的多因子特性，涉及TNF和IL-6以外的炎症和细胞毒性因子混合物。
细胞外琥珀酸抑制活化小胶质细胞的吞噬并改善线粒体呼吸
研究进一步发现，24毫摩尔的琥珀酸二钠预处理，可显著降低LPS刺激引起的BV-2细胞对荧光乳胶珠的吞噬活性，而对未受刺激细胞的吞噬活动没有影响。这表明细胞外琥珀酸能选择性地抑制过度活化的吞噬功能，而保留其基础功能。同时，研究利用人PBMC模型发现，LPS刺激导致PBMC的多种线粒体呼吸参数普遍下降。令人关注的是，琥珀酸二钠能够逆转LPS引起的常规呼吸和复合物I支持的OXPHOS的下降，并在复合物I+II支持的OXPHOS和最大解偶联呼吸参数上也显示出类似的逆转趋势。这一发现揭示了细胞外琥珀酸对小胶质细胞代谢的重要调节能力。琥珀酸对线粒体呼吸的改善作用，可能与其抑制吞噬功能的效应存在机制关联，因为吞噬是一个高耗能过程，与细胞代谢状态的转变密切相关。
讨论：位置依赖的信号机制与治疗潜力
本研究证实，琥珀酸在细胞外可作为一种新型的免疫调节性CNS DAMP，对小胶质细胞发挥以抗炎为主的作用。其细胞外作用包括：减少特定促炎细胞因子（TNF, IL-6）的分泌、减轻小胶质细胞介导的神经毒性、选择性下调免疫刺激状态下的过度吞噬活性，并能部分恢复免疫刺激细胞中的线粒体呼吸功能。重要的是，其中神经保护等效应是细胞内琥珀酸所不具备的，明确揭示了琥珀酸作用具有位置依赖性。
这种位置依赖性效应的机制可能源于激活不同的信号通路。细胞外琥珀酸可作为一种激动剂作用于细胞表面G蛋白偶联受体SUCNR1，后者在小胶质细胞中有表达。在周围巨噬细胞中，琥珀酸-SUCNR1信号通路可激活细胞内环磷酸腺苷（cAMP）依赖性通路，如蛋白激酶A（PKA）和转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，从而诱导抗炎调节因子KLF4的表达。而在细胞内，琥珀酸则可能通过SUCNR1非依赖机制发挥作用，例如在缺氧条件下稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），或作为琥珀酰辅酶A的底物促进赖氨酸琥珀酰化，从而调控代谢酶活性和炎症机制。
本研究的另一个重要发现是细胞外琥珀酸能够恢复LPS抑制的线粒体呼吸。炎症活化的小胶质细胞会发生代谢重编程，从氧化磷酸化转向糖酵解，以满足高能量需求。琥珀酸通过增加氧化磷酸化，可能限制了糖酵解的速率，从而减缓了依赖快速供能的吞噬过程，这为观察到的吞噬活性下降提供了一种可能的代谢机制解释。这种对细胞代谢的调节作用，将琥珀酸的信号功能与能量代谢调控联系起来，深化了对其免疫调节机制的理解。
结论：新型免疫代谢调节剂的前景
综上所述，本研究的数据表明，细胞外琥珀酸可能作为一种新型的免疫调节性DAMP在中枢神经系统发挥作用，对小胶质细胞主要产生抗炎效应。具体而言，位于细胞外空间的琥珀酸可减少小胶质细胞促炎细胞因子的分泌，减轻小胶质细胞介导的神经毒性，并有选择性地下调免疫刺激下小胶质细胞的过度吞噬活性。其中神经保护等效应是胞内琥珀酸所不具备的，这突出了该代谢物在细胞内外的位置是决定其对小胶质细胞作用的关键因素。此外，观察到的对细胞代谢的调节（恢复免疫刺激细胞的线粒体呼吸）可能代表了细胞外琥珀酸信号与吞噬活性调控之间的机制联系。因此，有必要开展进一步工作以全面阐明细胞外琥珀酸在小胶质细胞中参与的分子机制。
总体而言，这项研究扩展了我们对琥珀酸作为中枢神经系统免疫代谢调节因子的理解，揭示了其调节有害小胶质细胞活化的能力，这种活化已知会导致神经炎症和神经退行性变。鉴于其选择性的抗炎和代谢效应，细胞外琥珀酸可能代表了一种有前景的治疗策略，用于恢复神经系统疾病中的免疫稳态。未来利用人类小胶质细胞和脑类器官等先进体外模型进行研究，对于探索靶向琥珀酸信号通路在神经免疫疾病中的治疗潜力至关重要。
