《Microorganisms》：Enhanced Exopolysaccharide Production in Bidirectional Liquid Fermentation of Ganoderma lucidum Using Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau
Zhen Chen,
Shupei Zhang,
Zimeng Wang,
Pengru Li,
Wanying Du,
Jialu Li,
Dan Chen,
Mengyuan Yang,
Kexin Zheng and
Andong Gong
+ 2 authors
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本文通过将传统药用植物鳄嘴花（Clinacanthus nutans）作为基质引入灵芝（Ganoderma lucidum）双向液体发酵体系，显著提升了菌丝体生物量与胞外多糖（EPS）产量，并成功改造了EPS的结构。研究发现，优化发酵条件（6 g/L 鳄嘴花叶粉）可促使EPS的单糖组成从葡萄糖主导型转变为富含半乳糖的复杂型，分子量分布从低分子量均一型转化为双峰异质型（含显著的高分子量组分）。经此结构优化的EPS展现出显著增强的抗氧化活性（DPPH、OH、ABTS自由基清除率分别提升至55.5%、35.1%和88.0%）。这项研究为通过植物-真菌协同作用定向调控发酵过程，生产具有特定结构与功能的高附加值真菌多糖提供了新策略。
文章内容归纳总结
1. 研究背景与引言
灵芝（Ganoderma lucidum）作为一种著名的药用真菌，在亚洲传统医学中已有数百年的应用历史。现代研究证实，其广泛的健康促进作用，如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和降血糖等，主要归功于其生物活性多糖。全球灵芝产品市场庞大且持续增长，对这类生物活性化合物的需求旺盛。相较于具有较长生长周期和批次间差异的子实体人工栽培，通过液体深层发酵生产胞外多糖（Exopolysaccharide, EPS）展现出诱人前景，因其具备生产周期短、可控性强和可规模化等优势。然而，EPS的产量和生物活性高度依赖于发酵条件，这促使研究者们不断探索优化策略。
传统的发酵优化主要集中在物理化学参数上。近年来，双向液体发酵作为一种先进策略应运而生，其旨在通过利用特定植物底物与药用真菌共培养，来增强和定制真菌代谢物的生产。植物底物不仅作为营养源，还可作为生物刺激剂，可能诱导真菌的代谢重编程，从而合成具有增强生物活性的新型或结构修饰的化合物。本研究选取了具有悠久药用历史、富含类黄酮和多酚等生物活性物质的植物——鳄嘴花（Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau，俗称沙巴蛇草），作为灵芝发酵的药用基质。本研究假设，将鳄嘴花叶粉加入灵芝发酵培养基具有双重功能：一是提供碳、氮、矿物质和维生素等补充营养，直接支持菌丝生长和初级代谢，从而提高EPS产量；二是其特定的植物化学物质（特别是类黄酮和酚酸）可作为激发子，通过与真菌膜受体结合，激活信号转导通路，进而重编程涉及核苷酸糖生物合成和糖基转移酶活性的基因表达，改变碳流方向，最终合成结构更复杂的异质多糖。
2. 材料与方法
本研究通过实验系统评估了鳄嘴花对灵芝双向发酵的影响。首先，从多种药用植物底物中筛选出鳄嘴花作为最优基质。随后，确定了鳄嘴花叶粉的最佳添加浓度为6 g/L。通过设置不接种灵芝的培养基对照，排除了植物材料自身多糖浸出的可能性，确认了所获得的EPS完全来源于灵芝的发酵过程。
实验通过透析-乙醇沉淀法获得粗制EPS。对其进行了成分分析，包括蛋白质和总糖含量的测定。对EPS的结构进行了多层次的表征：利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析其官能团；利用离子色谱（IC）精确测定其单糖组成；利用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）分析其分子量分布。此外，还系统地评估了EPS的体外抗氧化活性，包括对DPPH自由基、羟基自由基（·OH）和ABTS自由基的清除能力。
3. 结果
3.1. 药用基质筛选与浓度优化
在初筛中，鳄嘴花叶粉对灵芝菌丝体生物量（提升61.78%）和EPS产量（提升116.6%）的促进作用最为显著，因此被选定为最优药用基质。浓度优化实验进一步表明，当鳄嘴花叶粉浓度为6 g/L时，菌丝体干重和EPS产量均达到峰值，此时EPS产量相比对照组增加了116.60%。非接种对照实验未检测到多糖沉淀，证实了EPS来源于真菌发酵而非植物直接浸出。
3.2. 结构表征结果
结构分析揭示了鳄嘴花叶粉的添加对EPS结构产生了深刻影响。
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官能团变化：FT-IR光谱显示，实验组EPS在1741 cm-1处出现了一个新的吸收峰，这可能归属于C=O的伸缩振动，提示可能存在羧基或酯基。此外，指纹区的特征峰从对照组的898 cm-1（β-构型特征）移动至实验组的862 cm-1（α-构型特征），表明鳄嘴花可能改变了EPS糖苷键的构型。
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单糖组成剧变：单糖组成分析结果最为显著。对照组EPS以葡萄糖为主（摩尔比高达0.936），结构较为单一。而实验组EPS则转变为一种复杂的异质多糖，其中半乳糖成为最主要的单糖（摩尔比0.556），并且检测到更丰富的单糖种类，包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸以及氨基糖等。这表明鳄嘴花的加入从根本上改变了多糖的单糖前体库。
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分子量分布转变：HPGPC分析表明，对照组EPS为低分子量（约4.7 kDa）的单一均匀组分。而实验组EPS则呈现双峰分布，包含一个显著的高分子量主峰（约38.5 kDa，占总峰面积的58.8%）和一个低分子量次峰（约4.4 kDa）。这表明鳄嘴花影响了聚合过程，导致了更高分子量和更异质化的EPS的生成。
3.3. 生物活性评估
结构上的优化直接转化为了功能上的增强。抗氧化活性测试显示，在所有测试浓度下，添加鳄嘴花后得到的实验组EPS对DPPH、羟基自由基和ABTS自由基的清除能力均显著高于对照组。在最高测试浓度2 mg/mL时，其清除率分别达到55.5%、35.1%和88.0%，相比对照组（31.7%、24.1%和45.1%）有显著提升。这种增强的抗氧化能力可归因于结构修饰：引入的糖醛酸提供了更多的羧基作为金属螯合位点和质子供体位点；更复杂的异质结构和更高的分子量也有利于自由基的淬灭。
4. 讨论与结论
本研究证实，在灵芝发酵培养基中添加6 g/L鳄嘴花叶粉，不仅能作为营养补充剂显著提高菌丝生物量和EPS产量，更能作为有效的代谢调节剂，深度重塑EPS的结构与功能。
产量提升的机制可能源于鳄嘴花提供的丰富营养成分及其所含的生物活性物质（如类黄酮、酚酸）作为激发子，激活了真菌的次级代谢通路。EPS结构的深刻变化，特别是从以葡萄糖为主的同质葡聚糖转变为富含半乳糖、糖醛酸和氨基糖的复杂杂多糖，表明鳄嘴花的添加可能通过上调UDP-葡萄糖-4-差向异构酶等关键酶的活性，改变了糖核苷酸前体库的组成和流向。分子量分布的转变（从低均一到高异质）则可能与糖基转移酶复合物的持续合成能力增强、植物来源寡糖引发的链延伸或胞外葡聚糖酶水解活性降低有关。
结构上的优化直接赋予了EPS更强的生物活性。新引入的糖醛酸、更丰富的活性羟基以及高分子量组分的出现，共同增强了其提供电子或氢原子的能力，从而表现出更优越的自由基清除活性。这些发现将植物基质的添加、真菌的代谢响应以及最终产物的功能性紧密联系在一起。
综上所述，本研究表明鳄嘴花是灵芝双向液体发酵的有效补充剂。它不仅能提高EPS产量，还能定向调控其结构，从而获得具有更强抗氧化活性的高价值杂多糖。这项研究凸显了双向发酵作为一种可持续、可调控的策略，在生产用于营养保健和医药应用的真菌多糖方面的巨大潜力。未来的研究可着眼于通过转录组学和代谢组学分析阐明鳄嘴花调控的具体代谢机制，以及通过进一步的分离纯化获得具有特定生物活性的EPS组分。
