玻璃表面ESKAPE病原体细胞壁成分差异影响其在动态剪切应力下的粘附适应性

《Microorganisms》：Different Cell Wall Compositions of ESKAPE Isolates on Glass Surfaces Impact Adhesion Adaptability to Dynamic Shear Stress Zhuoyi Cui, Anje M. Slomp, Alesia V. Quiroga, Jelly Atema-Smit, Hans J. Kaper and Brandon W. Peterson

本文探讨了ESKAPE病原菌在动态剪切力（7-60 s-1）作用下，在玻璃表面的初始粘附适应性。研究通过量化细菌表面密度和测量粘附强度（弹簧常数Ks），揭示了不同细菌（球菌vs.杆菌）在剪切力递增（保留指数RI）和递减（恢复指数RIDown）条件下的适应策略存在差异。这些适应性机制（保留与恢复）可能构成了细菌在变化环境中上调或下调响应以生存的基础，为理解其在医疗器械表面形成生物膜及引发感染性疾病的早期步骤提供了关键的力学视角。

　　

不同细胞壁组成的ESKAPE菌株在玻璃表面的差异及其对动态剪切应力下粘附适应性的影响

1. 引言

细菌感染已成为一项重大的公共卫生挑战。与ESKAPE病原体相关的众多感染，包括屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌属(Enterobacter spp.)，与它们粘附在医疗器械表面的能力密切相关。例如，金黄色葡萄球菌表现出对钛、钴铬合金和聚乙烯等骨科植入材料的强烈粘附能力，导致难以清除的生物膜形成。类似地，铜绿假单胞菌倾向于在导尿管表面定植，其中乳胶导管比PVC或硅胶导管更能促进其快速粘附和生物膜发展。

与医疗器械相关的细菌粘附给医院和水系统带来了重大挑战，可能导致医疗植入物失效并增加医疗成本。开发更有效的策略来预测和防止细菌粘附，可以增强医疗器械性能并降低感染风险。细菌能够探测潜在的不利因素，并产生应激反应以求生存。ESKAPE细菌因其产生抗菌素耐药性的能力而被充分记录，因此被选为适应性的研究对象。细菌在环境中持续生存的一个关键点是它们适应胁迫条件的能力，包括pH值、温度、营养可用性、氧含量和渗透压梯度的变化。虽然已经研究了多种环境刺激对微生物的影响，但机械和/或物理力变化对细菌的影响正变得越来越热门，因为它们是细菌生存的决定性因素，也是探索抗菌方法的重要考量。

近年来，人们对细菌在流体流动中行为的理解迅速扩展。例如，细菌如何感知流动和表面接触之间的关系已被广泛研究。此外，比较细菌如何感知和响应流动也很有价值，因为流动在生物膜形成中起主要作用。最近的证据表明，微生物可以感知和响应培养条件的变化。然而，这些研究主要考察了独立的剪切速率条件，缺乏对变化环境潜在适应性的分析。

虽然流体剪切物理力的变化在进化和微生物生理学中起着关键作用，但微生物细胞如何将这些力学信号转化为其行为以及它们是否适应这些变化仍不清楚。基于现有文献，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在内的几种细菌物种已被证明通过不同的力学感知和粘附策略来抵抗流体剪切力。然而，大多数现有研究采用了超过100 s^-1的稳态剪切条件来模拟动脉或工业状况，在生理性流动波动固有的微循环相关范围内（7-60 s^-1），理解细菌在动态剪切轨迹下的粘附方面存在关键空白。因此，本研究采用递增（7→15→30 s^-1; 15→30→60 s^-1）和递减（30→15→7 s^-1）的剪切率变化，系统研究剪切率的方向性变化如何调节细菌与表面的关联。实验设计旨在探究在生理相关流动波动发生的条件下，粘附特性如何随剪切率的方向性变化而适应。

本研究旨在确定不同细菌物种是否能感知其环境中的力学敏感性变化，从而触发生存反应。实验方法专注于短期内（前突变和前调控变化）与表面的早期关联。对与表面关联的细菌进行量化，并以每秒25帧的速度成像20秒，以观察布朗运动或受限布朗运动。与表面关联的细菌通过胞外分子的化学相互作用、细胞壁附属物以及细胞壁变形来强化粘附键，从而与表面相互作用。这些集体相互作用先前被归类为“系绳”，其总粘附键强度是所有附着系绳的总和。通过跟踪一系列图像中细菌的位置，分析了观察到的振动，并计算了关联的弹簧常数。计算了关联弹簧常数，以表征表面粘附的粘弹性性质的弹性部分。

为了确定任何适应的性质，在顺序增加剪切速率（为细菌提供额外能量）的同时，监控单个成像窗口。在测量期间，停止剪切以消除成像过程中的额外能量，然后再将剪切速率增加到序列中的下一个速率。此时暴露于较高剪切速率的表面关联细菌被称为被保留。相反，也顺序降低剪切速率以检查从高能剪切速率下的恢复。通过计算恢复与保留之间的比率，以突出所测试的六种细菌菌株之间的方向性适应模式。

2. 材料与方法

本研究选择了六种细菌菌株。六种被测菌株属于一组统称为ESKAPE病原体的细菌，包括粪肠球菌(Enterococcus faecalis) 1396、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC) 12600、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)-1、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)-1、铜绿假单胞菌(PAO1)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae BS) 1037。细菌在37°C的TSB培养基中生长。在最终洗涤后，将细菌重悬于PBS缓冲液中，并在冰水浴中超声处理以打散聚集体。最终实验用细菌悬浮液浓度调整为3 × 10⁸mL^-1。

使用自制的平行板流动室。流动室长17.5 cm，宽1.6 cm，高0.075 cm。不锈钢顶板和底板上有凹陷以安装玻璃显微镜载玻片，为流体运动创造平坦表面。在初始剪切速率下持续监测细菌粘附，直到观察到大约1 × 10⁶个细胞/cm²的细菌密度，此时停止流动15分钟。然后，使用连接了巴斯勒CCD相机的显微镜，以每秒25帧的速度记录20秒的表面关联细菌的连续图像。在收集图像后，施加中间剪切速率水平15分钟，接着是15分钟的停止期，然后捕获新的连续图像。然后对最终剪切速率重复此过程。所有实验均在单一校准温度下进行，以确保菌株间的可比性。每个细菌菌株在三种不同剪切速率和相同室温（22°C）下进行三次生物学重复实验。

实验剪切速率设置和分析数据分组如下：

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  处理组1：剪切速率递增，7→15→30 s^-1
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  处理组2：剪切速率递增，15→30→60 s^-1
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  处理组3：剪切速率递减，30→15→7 s^-1
  数据分析组（4-7组）将实验数据分类，以隔离变量进行对照分析。

通过基于图像的细胞计数对表面关联细菌进行量化。在采集过程中，研究跟踪并分析了视频序列的逐帧图像，并提取了由布朗运动或受限布朗运动产生的微小振动。这些振动通过细菌质心随时间的轨迹坐标来计算细菌的平均均方位移(MSD)，并通过GraphPad Prism拟合到回归曲线。通过非线性回归生成回归曲线并提取参数A、B和C。弹簧常数(Ks)从A = kT/Ks计算得出，其中k是玻尔兹曼常数(1.38 × 10^-23J K^-1)，T设为298.15 K。

为评估从初始剪切速率到最终剪切速率的行为变化，计算了表面关联密度的比率。对于递增的剪切速率，这被归类为保留指数(RI)，因为细菌在较高的剪切速率和相关的能量下保持与表面的关联。对于递减的剪切速率，这被归类为恢复指数(RI_Down)，因为细菌在较低的剪切速率和相关的能量下可以松弛和恢复。方向性指数(DI)是恢复指数与保留指数之间的比率。该值仅在起始和结束剪切速率互为倒数的情况下（组3恢复和组1保留）才有意义。

3. 结果

3.1. ESKAPE菌株在玻璃表面的表面关联细菌密度对不同剪切速率的适应

细菌在平行板流动室中随时间经历剪切速率的方向性变化，同时监测其与玻璃的表面关联细菌密度。为了解读变化剪切速率的适应效应，建立了三个处理组。在组1（7→15→30 s^-1）中，铜绿假单胞菌PAO1和金黄色葡萄球菌ATCC 12600的表面关联细菌密度显著增加。其他四种细菌在组1的任何条件下，其表面关联细菌密度均无显著变化。

在组2（15→30→60 s^-1）中，粪肠球菌1396的表面关联细菌密度从15 s^-1到60 s^-1显著增加。阴沟肠杆菌BS1037从15 s^-1到30 s^-1显著增强了表面关联细菌密度，但当剪切速率增加到60 s^-1时，显著差异并未维持。鲍曼不动杆菌-1、肺炎克雷伯菌-1、铜绿假单胞菌PAO1和金黄色葡萄球菌ATCC 12600在组2中的表面关联细菌密度没有差异。

随着剪切速率降低，鲍曼不动杆菌-1和阴沟肠杆菌BS1037在组3（30→15→7 s^-1）中显示出所有剪切速率之间的表面关联细菌密度均显著增加。此外，金黄色葡萄球菌ATCC 12600的密度在组3中显示出显著增加，但从30 s^-1到15 s^-1以及从15 s^-1到7 s^-1单独来看并不显著。其他三种细菌菌株在组3中的表面关联细菌密度没有显著变化。

3.2. ESKAPE菌株在相同剪切速率下玻璃表面的表面关联细菌密度控制

通过四个额外的对照评估来确定潜在混杂变量的影响。在组4（剪切速率为7 s^-1），鲍曼不动杆菌-1、阴沟肠杆菌BS1037和粪肠球菌1396的表面关联细菌密度在处理组1（未适应）和组3（剪切力降低）之间显著增加。在组5（剪切速率为15 s^-1），ESKAPE细菌的表面关联细菌密度没有显著差异。在组6（剪切速率为30 s^-1），仅金黄色葡萄球菌ATCC 12600的表面关联细菌密度在允许更多粘附时间并允许从较低剪切速率适应的情况下显著升高。

3.3. 方向性动态剪切下菌株特异性的表面关联细菌密度

在适度递增剪切速率（7-15-30 s^-1）下，表面关联细菌密度的保留显示出明显的菌株特异性差异。金黄色葡萄球菌ATCC 12600表现出高保留，RI值远高于拐点（RI = 1），表明其能够在较高剪切速率下持续附着。鲍曼不动杆菌-1、阴沟肠杆菌BS1037、铜绿假单胞菌PAO1和粪肠球菌1396显示出中等保留。相比之下，肺炎克雷伯菌-1的保留指数接近RI = 1，表明在递增剪切速率下表面结合和解离事件几乎相等。

当剪切速率范围扩展到更高值（15-30-60 s^-1）时，总体保留趋于下降，尽管菌株的相对排序大致保持不变。在剪切力降低期间，表面关联细菌密度的恢复也因菌株而异。鲍曼不动杆菌-1和金黄色葡萄球菌ATCC 12600表现出高恢复指数，表明在剪切力降低后表面关联得到强烈恢复。粪肠球菌1396、阴沟肠杆菌BS1037和肺炎克雷伯菌-1显示出中等恢复行为。铜绿假单胞菌PAO1也表现出中等恢复。

通过比较保留和恢复响应，进一步检查了方向性表面关联行为。log₁₀DI值揭示了清晰的菌株特异性模式。肺炎克雷伯菌-1由于在剪切速率增加时缺乏增强的表面关联，但在剪切速率降低时恢复表面关联而表现突出。鲍曼不动杆菌-1、阴沟肠杆菌BS1037和粪肠球菌1396也主要表现出正值，表明相对于保留有更强的恢复。相比之下，铜绿假单胞菌PAO1和金黄色葡萄球菌ATCC 12600的log₁₀DI值接近零，表明在相反方向的剪切速率变化下，对保留和恢复的亲和力基本对称。

3.4. ESKAPE菌株对不同剪切速率下玻璃粘附键强度的适应性（通过弹簧常数建模）

与玻璃表面的表面关联键强度通过相差显微镜的时间捕获图像和质心检测来确定位移，用于均方位移(MSD)计算。这些计算得出了细菌与玻璃表面之间的弹簧常数(Ks)，代表了细菌粘附韧带的一般刚度。较大的Ks表示更大的刚度和抗变形能力，而较小的Ks表示柔软度增加。在组1（7→15→30 s^-1）中，鲍曼不动杆菌-1、阴沟肠杆菌BS1037、肺炎克雷伯菌-1和铜绿假单胞菌PAO1的log₁₀(1/Ks)值随着剪切速率的增加而显著降低。这种趋势表明Ks值相应上升，意味着这些菌株的粘附系绳对压缩和拉伸的抵抗力更强，导致刚度更大。粪肠球菌1396和金黄色葡萄球菌ATCC 12600的弹簧常数在第一处理组中没有显著变化。

在组2（15→30→60 s^-1）中，鲍曼不动杆菌-1、粪肠球菌1396、肺炎克雷伯菌-1和金黄色葡萄球菌ATCC 12600的log₁₀(1/Ks)值随着剪切速率的增加而显著降低。其中，鲍曼不动杆菌-1和金黄色葡萄球菌ATCC 12600在30 s^-1和60 s^-1之间有额外的显著性。阴沟肠杆菌BS1037和铜绿假单胞菌PAO1的弹簧常数在整个剪切速率增加过程中没有差异。

在组3（30→15→7 s^-1）中，随着剪切速率降低，鲍曼不动杆菌-1、阴沟肠杆菌BS1037和肺炎克雷伯菌-1的log₁₀(1/Ks)值从开始到结束保持一致，没有显著变化。铜绿假单胞菌PAO1也保持一致。只有粪肠球菌1396和金黄色葡萄球菌ATCC 12600在整个实验过程中显示出显著的刚度变化。粪肠球菌1396的刚度随着剪切速率的调整而显著降低。相比之下，金黄色葡萄球菌ATCC 12600的刚度显著增加。

3.5. ESKAPE菌株对相似剪切速率下玻璃粘附键强度的适应性（通过弹簧常数建模）

在组4（剪切速率为7 s^-1），阴沟肠杆菌BS1037和粪肠球菌1396的弹簧常数在处理组1和组3之间显著降低。在组5（剪切速率为15 s^-1），鲍曼不动杆菌-1和阴沟肠杆菌BS1037的弹簧常数在处理组2和3之间显著降低。更多细菌菌株的弹簧常数在组6（剪切速率为30 s^-1）受到显著影响。在组7（剪切速率为15 s^-1且时间相同），没有细菌的弹簧常数显示出显著差异。