全基因组分析揭示野生大豆GsHIPP家族响应碱胁迫的分子机制及GsHIPP79的功能验证

《Plants》：Genome-Wide Analysis of HIPP Genes and Functional Analysis of GsHIPP79 in Response to Alkaline Stress in Glycine soja Chengbo Zhang, Zichun Wei, Deqiang Ding, Zaib_un Nisa, Xiaoxia Jin and Chao Chen

本研究通过全基因组分析在野生大豆 (Glycine soja) 中鉴定了79个HIPP (Heavy metal-associated isoprenylated plant protein) 家族基因，并揭示了GsHIPP79在增强植物耐碱性中的核心作用，为挖掘大豆抗逆基因资源和培育耐盐碱作物提供了重要理论基础。

　　

全基因组分析揭示野生大豆HIPP家族响应碱胁迫的分子机制及GsHIPP79的功能验证

引言

土壤盐碱化是限制全球农业生产力的主要环境因素。碱胁迫不仅会提高土壤pH值，还会引发离子毒性、渗透胁迫和营养失衡等一系列有害效应，最终抑制植物生长并降低作物产量。植物已发展出复杂的分子机制来应对碱胁迫，包括调节离子稳态、清除活性氧（ROS）、积累渗透调节物质以及调控胁迫相关基因的表达。重金属相关异戊烯化植物蛋白（HIPP）是一类以包含重金属结合（HMA）结构域和C末端异戊烯化基序为特征的特定蛋白家族。已有证据表明，HIPP家族成员不仅参与重金属转运和解毒，还参与植物对各种非生物胁迫的响应。然而，特别是来自野生大豆（Glycine soja）的GsHIPP家族基因在赋予植物耐碱胁迫方面的具体生物学功能仍知之甚少。本研究旨在鉴定G. soja中的HIPP家族基因，并探讨其在碱胁迫耐受中的作用。

结果

2.1. GsHIPP家族基因的鉴定

为了鉴定G. soja的HIPP基因，研究人员以拟南芥和水稻的HIPP家族蛋白序列作为查询序列，利用隐马尔可夫模型（HMM）进行筛选，最终在G. soja中获得79个潜在的HIPP家族基因，并根据染色体位置将其命名为GsHIPP1至GsHIPP79。GsHIPP家族蛋白的氨基酸残基长度范围在113（GsHIPP33和GsHIPP65）到560（GsHIPP37）之间，分子量（MW）范围为12.97424（GsHIPP33）到60.38506（GsHIPP37），理论等电点（pI）值在4.88（GsHIPP11）到10.05（GsHIPP52）之间。

2.2. GsHIPP家族基因的系统发育分析

为了探究HIPP基因的进化关系，本研究构建了包含G. soja、拟南芥和水稻HIPP蛋白序列的比较系统发育树。系统发育分析将79个GsHIPP蛋白分为五个不同的组（A至E），分别包含13、9、19、22和16个成员，表明家族内存在序列多样性和功能分化。

2.3. 保守基序和结构域分析

MEME（Motif-based Sequence Analysis Tools）基序分析显示，GsHIPP家族蛋白共享十个保守的基序序列。大多数蛋白质包含保守基序1、2、3、4和基序7。其中，基序1属于重金属关联结构域，基序2属于C端异戊烯化基序。

2.4. 染色体定位与同线性分析

分析表明，79个GsHIPP家族基因不均匀地分布在18条染色体上，没有表现出在特定染色体上明显聚集的偏好。此外，共鉴定出125对同线同源基因对，表明GsHIPP家族基因经历了全基因组或片段复制事件。

2.5. 启动子顺式作用元件分析

对GsHIPP基因启动子区顺式作用元件的分析显示，GsHIPP家族基因主要包含各种假定的激素相关元件，如茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）和生长素响应元件。同时还鉴定出了一些非生物胁迫响应元件，如防御和胁迫响应（TC-rich）、低温响应（LTR）和厌氧响应元件（ARE）。

2.6. 碱胁迫下的表达谱分析

转录组测序数据显示，在碱胁迫下，有18个HIPP家族基因表现出显著的差异转录水平。其中，11个基因表达上调，7个基因表达下调。这些结果表明G. soja HIPP家族基因可能参与了碱胁迫响应。在这些上调基因中，本研究进一步选择了GsHIPP79进行深入研究。qRT-PCR分析发现，GsHIPP79基因在G. soja的所有组织中均有差异表达，但在幼根中表达最高。在50 mM NaHCO₃处理下，GsHIPP79的表达在3小时迅速上调，并在6小时达到峰值。这些发现表明GsHIPP79在根中对碱胁迫高度响应。

2.7. GsHIPP79增强拟南芥的耐碱性

为评估GsHIPP79在植物碱胁迫响应中的功能，本研究在NaHCO₃处理下对野生型（WT）和两个GsHIPP79过表达株系（#3和#9）进行了表型分析。在正常生长条件下，各株系间在根长和鲜重等生长参数上没有显著差异。然而，在NaHCO₃胁迫下，虽然所有植株都表现出生长抑制，但转基因株系受的影响明显小于野生型。3胁迫下的耐受性">在碱胁迫下，GsHIPP79的转基因株系在根长和鲜重方面均表现出显著优势。生长抑制程度与NaHCO₃浓度呈正相关。这些结果证明，GsHIPP79增强了植物对碱胁迫的适应能力。

2.8. GsHIPP79提高叶绿素含量和抗氧化酶活性

在NaHCO₃胁迫下，转基因株系的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别比野生型高出21%、17%和18%。这些结果表明GsHIPP79转基因株系缓解了碱胁迫引起的光合色素降解。此外，转基因植株中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性均显著高于野生型。这些结果提示，GsHIPP79转基因株系通过协同激活多种抗氧化酶，增强了活性氧的清除能力，从而减轻了氧化损伤。3胁迫处理下GsHIPP79的生理指标及其对应激相关标记基因表达的调控">

2.9. GsHIPP79在碱处理下促进胁迫响应基因的表达

通过分析NaHCO₃处理下WT和转基因株系中六个胁迫相关标记基因（NADP-ME、H⁺-ATPase、COR15A、COR47、KIN1和RD29A）的表达水平，研究了GsHIPP79介导的碱胁迫响应机制。qRT-PCR结果显示，除KIN1外，NADP-ME、H⁺-ATPase、COR15A、COR47和RD29A在转基因植株中的表达水平均显著高于WT。具体而言，NADP-ME、COR15A、COR47和RD29A在NaHCO₃处理3小时和6小时时均表现出显著上调。H⁺-ATPase的表达在3小时未被显著诱导，而其转录水平在6小时显著增加。这些结果表明，GsHIPP79激活了胁迫响应基因的转录，对典型的胁迫标记基因（如RD29A和COR47）以及代谢相关基因（如NADP-ME）具有持续的促进作用。

2.10. GsHIPP79增强大豆毛状根的耐碱性

为了进一步验证GsHIPP79在响应大豆碱胁迫中的作用，本研究获得了转基因大豆毛状根。在非胁迫条件下，GsHIPP79转基因毛状根和K599对照之间没有观察到显著的表型差异。在碱胁迫处理下，所有毛状根的生长均受到明显抑制，但GsHIPP79转基因毛状根的抑制程度显著低于K599对照，其根长更长，鲜重更大。这一结果与在拟南芥转基因株系中观察到的表型一致，进一步证实了GsHIPP79在响应碱胁迫中的正向功能。3胁迫下的耐受性">在碱胁迫下，转基因毛状根中三种抗氧化酶（SOD、POD和CAT）的活性均显著高于K599对照。这些发现与先前拟南芥转基因系统的结果一致，表明GsHIPP79可以通过协同激活抗氧化酶来增强ROS清除能力，从而减轻碱胁迫诱导的氧化损伤。

讨论

本研究首次在G. soja中鉴定并表征了HIPP家族基因。多种证据支持GsHIPP家族的进化分岐。首先，在G. soja基因组中鉴定了79个潜在的HIPP家族基因，其数量高于大豆、茶树和玉米等其他物种，表明G. soja中可能存在基因复制和基因组复杂性。其次，与大豆中的HIPPs一致，GsHIPP蛋白在氨基酸残基、MW、pI和脂肪族指数方面差异显著，表明GsHIPP基因在G. soja基因组中发生了分化进化。第三，保守基序分析进一步证明了不同组之间的显著差异。然而，尽管GsHIPP家族基因存在进化分岐，但各组之间仍保持相对保守。例如，与其他物种一致，G. soja HIPP家族基因可被分为五组。大多数亚家族共享相似的保守结构域。同线性分析揭示了GsHIPP与AtHIPP之间存在62个同源基因对，与OsHIPP之间存在42个同源基因对。启动子区域的顺式作用调控元件参与多种元件，如非生物胁迫和激素相关。本研究中，GsHIPP家族基因也包含多种假定的激素相关或非生物胁迫响应元件，表明它们在响应各种胁迫中具有不同的潜在作用。此外，GsHIPP基因在碱胁迫下表现出不同的表达模式。为探究GsHIPP家族基因在碱胁迫下的功能作用，本研究选择了表达上调的GsHIPP79基因进行进一步验证。GsHIPP79的表达水平在碱胁迫下被显著诱导，且在根中表达最为显著。在拟南芥和大豆毛状根中过表达GsHIPP79均显著增强了植物对碱胁迫的耐受性。生物量的增加和根长的延长进一步验证了GsHIPP79在碱胁迫下根中的关键作用。碱胁迫可以激活植物细胞中的抗氧化防御系统。正如预期，GsHIPP79通过激活抗氧化酶（SOD、POD）和过氧化氢酶（CAT）来减轻碱胁迫下的氧化损伤，这与HIPP在氧化还原调节中的作用一致。先前研究表明，H⁺-ATPase和NADP-ME有助于耐盐碱性。此外，KIN1、COR15A、COR47和RD29A参与了对多种非生物胁迫（包括冷、盐或干旱胁迫）的响应。本研究中，qRT-PCR结果也显示，NADP-ME、H⁺-ATPase、COR15A、COR47和RD29A的表达在转基因植株中被显著诱导，表明GsHIPP79激活了胁迫响应基因的转录，对典型的胁迫标记基因具有持续的促进作用。

结论

综上所述，本研究在野生大豆中鉴定了HIPP家族基因，并研究了它们的理化性质、基因结构、系统发育关系、染色体定位和同线性。通过提高叶绿素含量、促进活性氧清除和激活胁迫响应基因的转录，证实了GsHIPP79在响应碱胁迫中的积极作用。然而，GsHIPP79参与碱胁迫信号通路的机制及其调控功能仍不清楚。进一步的研究应明确GsHIPP79在碱信号转导途径中的作用，并鉴定GsHIPP79的互作蛋白。此外，其他GsHIPP家族基因在响应碱胁迫中的作用仍有待阐明。