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本文研究布雷维毒素 PbTx-2 在人类单核细胞系 THP-1 中的免疫毒性效应。结果显示，亚致死浓度（2.8 和 5.6 μM）的 PbTx-2 暴露可下调过氧化氢酶（CAT）和铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）活性，并诱导谷胱甘肽还原酶（GRd）基因表达上升。此外，促炎细胞因子 IL-8 表达上调，而 IL-1β 和 TNF-α 表达下调，表明毒素在非细胞毒性条件下仍可干扰免疫细胞功能。本研究为理解布雷维毒素通过氧化-炎症通路介导免疫功能障碍提供了新证据。
1. 引言
布雷维毒素（Brevetoxins, PbTxs）主要由 Raphydophiceae 纲的微藻（如 Karenia brevis 和 Chatonella spp.）在赤潮期间产生。目前已鉴定出多种 PbTxs，按其聚醚结构分为 A 型和 B 型，其中 B 型以 PbTx-2、PbTx-3 和 PbTx-9 为主。PbTxs 是脂溶性环状聚醚化合物，可通过特异性结合电压敏感钠通道的 α 亚单位第 5 位点，导致通道激活电压负向偏移并延缓其失活，进而引发钠离子内流增加，改变神经元、心肌细胞等可兴奋细胞的膜特性。人类主要通过摄入受污染的水产品或吸入含毒素的气溶胶而遭受神经毒性贝类中毒（Neurotoxic Shellfish Poisoning, NSP），其致死剂量在纳摩尔浓度范围内。临床症状包括胃肠道与神经系统异常组合表现，毒素气溶胶还可能诱发干咳、眼鼻瘙痒、哮喘发作及慢性阻塞性肺疾病加重等。
尽管 PbTxs 在组织中的具体结合位点尚不明确，但已有研究提示其可能与淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞结合，或与脂蛋白结合后通过循环系统转运。在哺乳动物免疫细胞系中，PbTxs 暴露可影响细胞生长、增殖并诱导细胞凋亡。此外，多项研究表明 PbTxs 可导致氧化应激与炎症反应，例如在暴露于赤潮的海牛血浆中超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高，在小鼠骨髓来源的肥大细胞中 PbTx-2 触发脱颗粒并增加白细胞介素-6（IL-6）水平，而在肺泡巨噬细胞系 MH-S 中 PbTx-2 可增强吞噬作用并促进 IL-2、IL-4 和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的释放。
然而，目前许多国家尚未对 PbTxs 实施严格监管，而有害藻华（Harmful Algal Blooms, HABs）的发生频率正不断增加，亚致死剂量暴露对人类健康的长期影响更是未知。PbTx-2 作为布雷维毒素 B 家族的“母体”毒素，其含量较丰、生物活性较高，是研究其免疫毒性的理想模型。因此，本研究旨在以人类单核白血病细胞系 THP-1 为体外模型，探讨 PbTx-2 对细胞活力、氧化应激以及促炎细胞因子和抗氧化酶基因表达的影响，为阐明 PbTxs 在系统毒性及免疫病理中的作用提供依据。
2. 材料与方法
THP-1 细胞在含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中培养，并于 37°C、5% CO2的湿润条件下维持。细胞活力通过 MTT 法检测，结果显示 PbTx-2 处理 24 小时的半抑制浓度（IC50）为 8.99 μM（8.047 μg mL?1）。亚致死浓度（2.5 和 5.0 μg mL?1，即 2.8 和 5.6 μM）处理 4 小时和 8 小时不影响细胞存活率。
采用 2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）测定细胞内活性氧（ROS）水平，并以脂多糖（LPS, 1 μg mL?1）作为阳性对照。结果显示，4 小时 PbTx-2 暴露未引起 ROS 产生变化，而 LPS 处理则显著升高 ROS 水平；8 小时暴露于 2.5 μg mL?1PbTx-2 后，细胞内 ROS 产生反而显著降低。
通过分光光度法检测过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，发现 8 小时 PbTx-2 暴露导致 CAT 活性下降约 50%，SOD 活性则降低 32 倍。
使用实时定量 PCR（qPCR）分析促炎细胞因子（IL-1β、IL-8、TNF-α）和抗氧化酶基因（CAT、GPx、GRd、Cu/Zn-SOD）的表达变化。结果显示，IL-1β 和 TNF-α 的转录水平下降，而 IL-8 表达在 8 小时暴露后上调。抗氧化酶基因中，CAT 和 GPx 表达下调，GRd 转录水平则显著升高。所有数据经正态性与方差齐性检验后，采用因子方差分析（ANOVA）及 Tukey 事后检验进行统计处理，以 p < 0.05 为显著性标准。
3. 结果
3.1. IC50测定与细胞活力检测
在 THP-1 细胞中，PbTx-2 的 24 小时剂量-效应曲线显示，0.5–7.5 μg mL?1（0.6–8.4 μM）处理组与对照组相比无显著差异，但 7.5 μg mL?1时细胞活力降至约 80%。IC50值为 8.047 μg mL?1（8.99 μM）。最高浓度 10 μg mL?1（11.2 μM）处理使活力显著降至 17%。后续实验均采用低于 IC50的亚致死浓度（2.5 和 5.0 μg mL?1），处理 4 小时和 8 小时后细胞活力与对照组相比无显著差异。
3.2. PbTx-2 对 ROS 产生与抗氧化酶活性的影响
4 小时暴露于 2.5 和 5.0 μg mL?1PbTx-2 未改变 THP-1 细胞的 ROS 水平，而 8 小时暴露于 2.5 μg mL?1时 ROS 产生显著降低。在酶活性方面，8 小时 PbTx-2 暴露导致 CAT 活性下降约 50%，SOD 活性亦显著降低 32 倍。
3.3. PbTx-2 对基因表达的影响
促炎细胞因子 IL-1β 和 TNF-α 的基因表达在 2.5 和 5.0 μg mL?1PbTx-2 处理 4 小时和 8 小时后均下调。与之相反，IL-8 表达在 8 小时暴露后上调。抗氧化酶基因中，CAT 和 GPx 表达下调，而 GRd 转录水平在 4 小时和 8 小时处理后均升高。Cu/Zn-SOD 的 mRNA 水平在各处理条件下保持相对稳定，但 8 小时暴露于 5.0 μg mL?1PbTx-2 时，CAT 表达显著下调。
4. 讨论
PbTxs 对免疫细胞的作用机制尚不完全清楚，现有证据表明其可调控先天性与适应性免疫应答。本研究中，PbTx-2 仅在最高浓度（10 μg mL?1）下显著降低 THP-1 细胞活力，IC50值为 8.99 μM，高于此前报道的某些淋巴细胞系（如 Jurkat E6-1 细胞的 5.6 μM），提示不同细胞类型对毒素的敏感性存在差异。
过量的环境毒素暴露可导致 ROS 生成增加。本研究中，4 小时 PbTx-2 暴露未引起 ROS 升高，而 8 小时后 ROS 水平反而下降，这可能反映了细胞抗氧化机制的快速激活。CAT 和 SOD 活性在 8 小时后的降低，以及 GRd 基因表达的上调，表明细胞通过增强谷胱甘肽循环以维持氧化还原稳态，进而消耗了抗氧化酶储备。
在炎症反应方面，PbTx-2 暴露导致 IL-8 表达上调，这与 Jurkat T 细胞中观察到的反应相似，提示毒素可能通过促进细胞迁移而激发局部免疫活化。然而，IL-1β 和 TNF-α 的转录水平却受到抑制，此结果与 McCall 等（2022 年）在相同细胞模型中未检测到这些细胞因子分泌的报道一致。这种差异可能源于不同免疫细胞群体中电压门控钠通道（VGSC）亚型的表达特异性，从而导致趋化信号优先于促炎激活。
尽管本实验所用浓度（2.5–10 μg mL?1）高于 Karenia brevis 赤潮期间海水中常见的 3–30 μg L?1，但在海洋哺乳动物或人类中，毒素通过摄食或吸入气溶胶进入体内后可发生生物富集，使得局部组织（如肺、肝）中的毒素浓度显著升高。因此，本研究所用浓度对模拟生物累积后的细胞应激仍具有相关性。
综上所述，PbTx-2 在 THP-1 细胞中引发的时间依赖性毒性机制包括：初期可能由毒素与电压门控钠通道相互作用触发氧化挑战，随后细胞抗氧化防御系统被激活，导致 SOD 和 CAT 活性耗竭；同时，GRd 表达上调表明细胞优先利用谷胱甘肽依赖途径应对化学应激。这种氧化还原状态（GSH/GSSG 比值）的改变可能激活 NF-κB 或 MAPK 等氧化还原敏感通路，最终引起 IL-8 和 TNF-α 转录水平的变化。该研究结果提示，PbTx-2 的免疫毒性涉及抗氧化耗竭与代偿性炎症反应的级联过程。
5. 结论
本研究证明，亚致死浓度（2.8 和 5.6 μM）的 PbTx-2 可在 THP-1 人单核细胞中调控氧化还原与炎症通路。8 小时暴露后，抗氧化酶 SOD 和 CAT 活性降低，同时谷胱甘肽还原酶（GRd）和 IL-8 表达上调，而 IL-1β、TNF-α 和 CAT 表达显著下调。这些发现表明，即使在非细胞毒性条件下，PbTx-2 仍可通过氧化应激与炎症反应机制发挥免疫调节作用。鉴于气候变化导致有害藻华日益频繁，加强对海产品及海洋环境中 PbTx 水平的监测至关重要。今后需进一步研究长期低剂量暴露对人类及海洋哺乳动物免疫系统的潜在影响，以评估布雷维毒素生物累积带来的长期健康风险。
