新型生防菌贝莱斯芽孢杆菌LYH8对小麦赤霉病的多重调控机制与毒素抑制研究

《Journal of Fungi》：Identification of the Biocontrol Effect of Bacillus velezensis LYH8 Against Fusarium Head Blight of Wheat Yihua Liao, Jiayi Shen, Tian Yang, Huijuan Peng, Tingwei Qi, Yan Li and Chengcheng Li

这篇研究性论文系统鉴定了从湖北荆州分离的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株LYH8对小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum， FHB）的生防潜力。研究发现，LYH8不仅能有效抑制病原菌丝生长（抑制率达43%），诱导菌丝形态畸变，还能在活体小麦上显著降低病害严重度（75-85%）和籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其衍生物D3G的积累（20-22%）。通过转录组分析进一步揭示了LYH8通过调控氨基酸合成、核糖体生物合成及碳代谢等多条通路影响病原菌生长的分子机制，为开发绿色、高效的小麦赤霉病生防制剂提供了重要的理论和技术依据。

　　

新型生防菌贝莱斯芽孢杆菌LYH8对小麦赤霉病的生防效应鉴定

1. 引言

小麦是全球核心粮食作物，其安全生产对粮食安全至关重要。由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的小麦赤霉病（Fusarium head blight, FHB）是一种严重的真菌病害，不仅造成产量损失，其产生的真菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）更对人类和动物健康构成严重威胁。目前，FHB的防治主要依赖有限的抗病品种和化学杀菌剂，面临着病原适应、抗药性增强及环境污染等挑战。因此，开发高效、安全、环境友好的生物防治方法具有重要意义。芽孢杆菌属（Bacillus）微生物因其强抗逆性、广谱抗菌活性和丰富的生物活性代谢物，成为研究与应用最广泛的生防菌类群之一。其中，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）作为一种革兰氏阳性植物根际促生菌（PGPR），在生防领域展现出巨大潜力，其作用机制包括直接分泌抗菌物质（如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素等脂肽抗生素）和诱导系统抗性。尽管B. velezensis在防治多种作物病害中显示出潜力，但其对F. graminearum生长及DON合成的抑制效应，尤其是结合转录组学阐明其作用机制的研究仍有限。本研究对从荆州分离的一株新芽孢杆菌LYH8进行了系统研究，旨在评估其对FHB的生防潜力，并初步探索其作用模式。

2. 材料与方法

2.1. 试验样品与培养基

试验所用野生型F. graminearumPH-1和B. velezensisLYH8均保藏于长江大学农学院分子生物学实验室。使用培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、LB固体/液体培养基、绿豆汤培养基和YEPD培养基。

2.2. 菌株LYH8的鉴定

通过扩增并测序16S rRNA和gyrB基因，进行同源性分析和系统发育树构建，对菌株进行分子鉴定。使用最大似然法在MEGA 11.0软件中构建系统发育树，以B. cereusATCC 14579作为外群。

2.3. 体外拮抗试验

采用平板对峙法评估LYH8对F. graminearumPH-1的拮抗活性。在距PDA平板中心2.5 cm处十字交叉打四个小孔，加入LYH8菌悬液（OD₆₀₀= 0.6, 1 × 10⁸CFU·mL^?1），中心放置病原菌菌饼。培养3天后测量菌落直径并计算抑制率。

2.4. LYH8无细胞发酵滤液对F. graminearum菌丝生长的影响**

制备LYH8的无细胞发酵滤液，按1%、5%、10%、20%浓度加入PDA培养基中，倒入平板。中心接种病原菌菌饼，以不含发酵液的PDA平板为对照。培养3天后测量菌落直径。

2.5. 共培养条件下F. graminearum和LYH8的菌丝结构**

将F. graminearum孢子悬液与LYH8菌悬液等体积共接种于YEPD液体培养基，分别培养24 h和48 h。在光镜下观察形态。同时，刮取抑菌圈边缘的气生菌丝，经固定、脱水、干燥、喷金后，在扫描电镜下观察超微结构。

2.6. LYH8对F. graminearum的防治效果**

采用小麦胚芽鞘和单穗接种法评估。对胚芽鞘先接种LYH8菌悬液，24 h后再接种病菌，7天后测量病斑长度。在扬花期对麦穗喷洒LYH8菌悬液，24 h后对基部第5小穗注射孢子悬液，14天后记录发病率并收集病粒。

2.7. 小麦籽粒中毒素含量的测定

研磨病粒样品，用乙腈-水混合液提取，经固相萃取柱净化、衍生化后，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其衍生物脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（D3G）的含量。

2.8. F. graminearum的基因表达

将F. graminearum孢子悬液与LYH8菌悬液在YEPD液体培养基中共培养48 h，提取总RNA进行转录组测序。使用Hisat2进行序列比对，DESeq2筛选差异表达基因（DEGs，筛选标准：|log₂(fold change) | ≥ 2, p≤ 0.01, FDR < 0.01）。利用GO和KEGG数据库对DEGs进行功能注释和富集分析。通过qRT-PCR验证测序结果。

2.9. 统计分析

使用SPSS Statistics 20.0软件进行统计分析。两组比较采用非配对学生t检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验。p< 0.05被认为具有统计学显著性。

3. 结果

3.1. 菌株LYH8鉴定结果

基于分子系统发育分析，菌株LYH8被鉴定为B. velezensis。其16S rRNA和gyrB基因序列与B. velezensis菌株8-4的序列一致性达99.96%。系统发育树显示，LYH8与B. velezensis菌株8-4形成一个高支持度的分支（自展支持值100%）。

3.2. 菌株LYH8对F. graminearum的抗真菌活性**

菌株LYH8对F. graminearumPH-1表现出强烈的抗真菌活性。平板对峙试验结果表明，该菌株对PH-1菌丝生长的抑制率高达43%。

3.3. 无细胞发酵液对F. graminearum菌丝生长的影响**

LYH8的无细胞发酵液对F. graminearumPH-1的菌丝生长具有显著的抑制作用。其抗菌活性与发酵液浓度梯度的增加呈正相关。

3.4. LYH8对F. graminearum菌丝形态的影响**

光镜和电镜观察比较发现，LYH8处理组与未处理对照组相比，病原菌菌丝形态存在显著差异。对照组菌丝表面光滑、直径均匀、排列规则。而处理组部分菌丝发生断裂，末端明显膨大凸起，并伴有结构塌陷、皱缩等异常形态特征。这些结果表明LYH8显著抑制了F. graminearum的菌丝生长。

3.5. 菌株LYH8对小麦赤霉病的防治效果

通过小麦胚芽鞘和单穗接种试验评估了菌株LYH8对F. graminearum致病力的影响。结果表明，经LYH8处理后，胚芽鞘和麦穗上的病害严重度均显著降低。具体而言，LYH8处理使小麦胚芽鞘和麦穗的病害严重度降低了75-85%。

3.6. LYH8对小麦籽粒中DON和D3G积累的影响

气相色谱-质谱分析显示，经LYH8处理后，染病小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其衍生物脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷（D3G）的含量分别降低了20-22%。

3.7. 转录组分析揭示LYH8的作用机制

对共培养48小时的样品进行转录组测序分析，共鉴定出大量差异表达基因（DEGs）。GO功能富集分析表明，这些DEGs显著富集在与氨基酸生物合成、核糖体生物合成、碳水化合物代谢过程以及催化活性等相关的条目中。KEGG通路富集分析进一步揭示，DEGs主要涉及氨基酸生物合成、核糖体、碳代谢、丙酮酸代谢以及糖酵解/糖异生等代谢通路。这些结果表明，LYH8可能通过干扰病原菌的关键代谢途径，特别是氨基酸和蛋白质合成以及能量代谢，来抑制其生长和毒素合成。

4. 讨论与总结

本研究系统评价了新分离的贝莱斯芽孢杆菌LYH8对小麦赤霉病的生防潜力。结果表明，LYH8能有效抑制病原菌F. graminearum的菌丝生长，并引起菌丝形态异常。活体试验证明，LYH8处理可显著减轻小麦胚芽鞘和穗部的病害症状，并降低籽粒中主要真菌毒素DON及其衍生物D3G的含量，这对保障粮食安全和食品安全具有重要意义。进一步的转录组学分析从分子层面揭示了LYH8的作用机制，表明其通过调控病原菌的氨基酸合成、核糖体组装、碳代谢等多个关键生物学过程和通路，从而发挥抑菌作用。综上所述，菌株LYH8通过抑制菌丝生长、降低侵染能力和阻断毒素合成等多重机制，显著控制了小麦赤霉病，展现出强大的生防潜力。本研究为深入理解贝莱斯芽孢杆菌防治镰刀菌病害的机理提供了新见解，也为开发针对小麦赤霉病的绿色生防制剂奠定了理论与技术基础。