《Epigenomes》：Mutant KRAS Heterogeneity Shapes Nuclear Architecture During Pancreatic Cancer Initiation
Gareth Pollin,
Angela J. Mathison,
Elise N. Leverence,
Thiago Milech De Assuncao,
Juan Iovanna,
Johnny C. Hong,
Michael T. Zimmermann,
Raul Urrutia and
Gwen Lomberk
KRAS突变驱动胰腺癌起始的早期核架构与表观遗传异质性
1. 引言
胰腺导管腺癌（PDAC）中约90%的病例存在KRAS基因的激活突变，这是疾病发生早期的决定性事件。这些突变驱动广泛的转录与结构重编程，将正常胰腺上皮细胞转化为具有异常核组织与信号动力学的癌前表型。KRAS的传统研究集中于其胞质角色，如激活MAPK、PI3K和NF-κB信号通路，但近期研究发现其对核内过程也具深远影响，包括染色质重塑、转录调控和RNA加工。一个明确的例子是常染色质组蛋白甲基转移酶EHMT2，它在KRAS G12D下游发挥作用，与EHMT1和WIZ形成复合物，在基因组位点沉积H3K9me2，从而调节细胞生长、抑制细胞周期抑制网络、重塑免疫与炎症反应程序，并建立抑制性染色质状态，最终驱动胰腺组织中转录输出的改变。通过重编程EHMT2等表观遗传调节因子，KRAS信号建立了一个维持致癌基因表达并促进PDAC发病的核环境。
PDAC中的KRAS突变主要涉及G12位的单个氨基酸替换。最常见的突变是G12D、G12V和G12R，此外还有G13和Q61等位点发生的频率较低的变异，共同构成了疾病的突变与功能异质性。这些突变决定了下游信号的强度与性质。G12D和G12V突变强烈激活ERK和AKT通路，而G12R的信号输出较弱，且在多个人类大型临床队列中始终与更好的患者生存率相关。先前研究表明，KRAS G12D信号通过重组染色质区域和破坏核纤层完整性来重塑核结构，建立了一个促进增殖、应激耐受和转化相关基因表达程序的独特核景观。此外，内核膜组分已成为KRAS活性的功能效应器，将致癌信号与核结构的物理重塑及染色质压缩相联系。尽管已有这些进展，我们对KRAS驱动的核组织的理解主要基于对KRAS G12D的研究，其他临床常见KRAS变异体对核架构的差异化影响仍知之甚少。
本研究在非癌性胰腺导管上皮细胞中模拟突变型KRAS的早期表达，以明确对致癌信号的最早期分子与结构响应。首先，我们利用整合的转录组学与磷酸化蛋白质组学方法，分析了一组与PDAC相关的KRAS变异体，建立了富含表观遗传调节因子和核结构因子的突变特异性调控程序。在这些数据集揭示的显著表观遗传与转录异质性的指引下，我们随后聚焦于两个差异最显著的变异体——最常见的KRAS G12D和临床特征独特的KRAS G12R，并应用深入的细胞成像技术，研究这些不同的表观遗传状态如何转化为差异性的核重塑。这些结果共同描绘了致癌KRAS信号最早期的、由表观遗传驱动的核后果，并将核异质性确立为变异特异性PDAC起始的一个基本特征。
2. 结果
2.1. PDAC相关KRAS信号启动早期变异特异性核调控转录程序
为表征KRAS突变如何启动早期核重塑，我们在诱导八种常见PDAC相关KRAS突变（G12C、G12D、G12V、G12R、G13D、Q61H、Q61K、Q61R）及显性失活对照S17N 24小时后，在非癌性胰腺导管上皮细胞模型HPNE细胞中进行了RNA测序。蛋白质印迹分析证实所有诱导的KRAS变异体在24小时表达量相当，确保下游效应反映的是突变差异而非表达水平差异。转录组分析同样显示各条件间KRAS mRNA水平相当，NRAS或HRAS表达无变化。
随后进行的基因集富集分析（GSEA）揭示了突变特异性的核相关转录程序的显著激活。核糖体生物合成（核仁重塑的标志）在G12C、G12D、G12V、G13D、Q61H、Q61K和Q61R中显示出强烈的早期富集，而G12D的富集程度最低，与野生型KRAS相当，S17N则显示耗竭。这些数据表明，核糖体生物合成和核糖体RNA程序的激活构成了对致癌KRAS信号的保守早期响应，而G12D的活性更接近野生型而非其他致癌变异体。
除核糖体生物合成外，还出现了其他突变特异性的通路差异。G12D选择性抑制甲状腺激素信号，而G12C和Q61K适度激活此通路。DNA复制通路在G12C、G12D、G12V、G13D、Q61K和Q61R中强烈富集，但在野生型KRAS或G12D中则不然。碱基切除修复在大多数变异体中活跃，但在G12D中显著缺失；非同源末端连接在G12D、G12V和Q61K中选择性富集。此外，同源重组在野生型KRAS、G12C、G12D和Q61R中优先富集，突出了变异体对特定DNA修复程序的特异性依赖。显性失活S17N突变体抑制了所有复制与修复通路，证实了它们对活性KRAS信号的依赖。RNA加工通路也呈现出变异特异性模式。RNA聚合酶激活在致癌KRAS变异体中广泛发生，G12D是显著例外。RNA降解通路在野生型KRAS和大多数变异体中启动，但在G12D和G12R中缺失。
为进一步剖析早期核重塑，我们基于基因本体细胞组分注释，分析了60个与染色质重塑、核膜组分和核仁功能相关基因的转录变化。大多数基因在致癌KRAS变异体中显示协调调控，表明存在共享的早期核重塑转录框架。G12D再次表现不同，引发整体较弱的响应，而S17N显示出与致癌KRAS突变体相反的调控模式。这支持了一个模型，即与G12R相关的减弱的下游信号保留了核调控状态，而其他致癌变异体则积极重塑这些状态。
为量化整体重塑程度，我们计算了核转录重塑分数（NTRS），即每个条件下核相关基因上调和下调的平均log2倍数变化。G12D、G12V、G13D、Q61H和Q61R显示出相似的正向NTRS值（0.59至0.65）以及同样强烈的负向分数（-0.52至-0.72），与协调的双向转录重编程一致。G12C和Q61K显示出最高的正向NTRS值（分别为0.72和0.73），同时伴有显著的负向分数，表明强大的重塑能力。野生型KRAS表现出更适度的双向活性（正向NTRS 0.48；负向-0.37），低于致癌变异体。G12D显示出进一步减弱，正向NTRS为0.35，负向分数显著较弱（-0.19），反映出比野生型KRAS更有限的核转录重塑。显性失活S17N对照产生了最高的双向NTRS值，但这反映了相对于致癌KRAS变异体的反向转录程序，而非典型核转录响应的增强。
2.2. 磷酸化蛋白质组学分析揭示致癌KRAS下游的差异性核信号
接下来，我们使用基于抗体的阵列进行了磷酸化蛋白质组学分析，以量化KRAS变异体间蛋白质丰度和磷酸化的变化，比较+多西环素样本与它们匹配的未加多西环素对照。对核相关蛋白质的分析揭示了KRAS变异体间早期蛋白质丰度的显著异质性。G12D和Q61R，连同S17N，在诱导后显示出最高的总体蛋白质丰度。G13D和Q61H也增加了蛋白质丰度，但程度较轻。相比之下，G12C、G12V和Q61K显示诱导最小或丰度降低。
在蛋白质丰度水平上，这些例子表明，大多数致癌KRAS变异体增强了早期核RNA和染色质调控能力，而G12D对这些响应的参与有限，并在特定的核效应器上表现出差异。
基于这些蛋白质丰度差异，我们进一步检查了磷酸化，以确定核因子的翻译后调控是否因KRAS突变体而异。HDAC1在Ser421位点的磷酸化（这是酶活性和转录抑制所需的修饰）显示出明显的变异体特异性。G12D显示出最强的诱导（+1.03），其次是G12V（+0.73）和Q61R（+0.52），而G13D、Q61K、G12C和Q61H显示出最小到适度的变化。G12D显示磷酸化降低（-0.15），与S17N（-0.37）相似，表明该表观遗传调节因子的激活减弱。HDAC2在Ser394位点的磷酸化也发现了类似的模式，该修饰促进酶活化、与HDAC1异源二聚化以及募集至转录活跃染色质。HDAC2 Ser394磷酸化在G12D中最高（+0.68），在G13D、Q61H、Q61R、G12V和Q61K中普遍升高。相比之下，该位点的磷酸化在G12C和G12R中降低。
DDX5在Tyr593位点的磷酸化（一种调节核输出和信号活性的修饰）显示出独特的变异特异性分布。Q61K、G12C和G13D显示出最高的Tyr593磷酸化水平，G12R、G12V和Q61H有中度增加。Q61R在该位点变化可忽略。值得注意的是，G12D显示出Tyr593磷酸化降低（-0.63），使其区别于其他致癌KRAS变异体。
最后，TP53在Ser15位点的磷酸化（一种由ATM和ATR激酶介导的典型DNA损伤响应修饰）进一步区分了突变特异性的核应激信号。p53 Ser15磷酸化的最强诱导出现在Q61R（+2.39），在Q61H、G12D和G13D中也检测到显著增加。G12V和Q61R在该位点变化最小，而G12C和Q61K显示磷酸化降低。G12D显示出最大的抑制（-0.62），与其他KRAS突变体相比，早期DNA损伤信号和核致癌应激减弱。
这些磷酸化模式表明，致癌KRAS变异体不仅通过改变蛋白质丰度，还通过变异特异性的翻译后信号传导来驱动早期核调控。在染色质调节因子、RNA结合蛋白和DNA损伤响应效应器中，大多数PDAC相关的KRAS突变体在激活后24小时内参与了协调的磷酸化程序，以增强核调控活性。G12D在多个调控节点上持续显示出减弱或差异性的磷酸化，通常类似于显性失活对照。
当与转录和总蛋白质丰度数据整合时，这些结果表明，致癌KRAS突变在非癌性胰腺上皮细胞中24小时内编码了一系列早期核调控状态，从而为突变型KRAS表达持续时的进行性失调做好了核准备。G12D和G12R占据了这一光谱的两端，G12D广泛参与核调控和应激响应通路，而G12D在转录、蛋白质组和磷酸化蛋白质组层面显示出减弱或差异性的信号传导。G12C和Q61K等中间变异体在这一连续谱中显示出通路特异性偏差。这些发现支持了一个模型，即早期突变型KRAS信号建立了变异特异性的核轨迹，这可能影响PDAC起始期间随后的染色质重塑和核架构重组。
2.3. KRAS G12D和G12R在胰腺上皮细胞中驱动不同的核与亚核重塑
前述的多组学分析揭示了PDAC相关KRAS变异体间早期核调控信号的显著异质性，其中KRAS G12D和G12R代表了转录和蛋白质组重塑的两个极端。为确定这些分子差异是否转化为可测量的核组织变化，我们将定量成像分析聚焦于G12D和G12R。在KRAS诱导后24和48小时评估核特征，以便为转录变化提供足够的形态表现时间。
KRAS G12R表达在24或48小时均未显著改变相对于0小时对照的平均核面积。G12D在24小时无变化，但到48小时导致核面积减少16%，表明随时间推移发生核压缩。然后通过圆形度评估核形状，其中值1代表最大圆形核。表达G12D的核圆形度从基线0.84增加到24小时的0.88，并在48小时保持，与伴随压缩的进行性核圆化一致。相比之下，G12R表达在24小时无变化，仅在48小时有限降低（0.86至0.84）。这些测量表明G12D快速重塑核架构，而G12D诱导最小且延迟的变化。
鉴于核糖体生物合成通路的富集以及核仁相关转录程序，我们接下来检查了突变型KRAS是否改变了核仁组织。使用核仁素和原纤维蛋白量化核仁大小，以捕获功能不同的核仁亚区室的变化。在基线，表达G12D的细胞显示各个核仁组分的面积相当。G12D诱导24小时后，核仁素阳性面积增加41%至2.43 μm2，并在48小时进一步扩大至2.65 μm2（54%）。原纤维蛋白阳性区域显示出类似的轨迹，在24小时增加至1.97 μm2（30%），在48小时增加至2.14 μm2（41%）。相比之下，表达G12R的细胞具有相似的基线值，但随时间推移扩展有限。24小时后，核仁素和原纤维蛋白面积分别增加16%和25%，这些值在48小时基本保持不变。因此，G12D驱动核仁亚区室的协调扩大，与核糖体生物合成升高一致，而G12R仅支持有限的核仁扩展。
最后，我们使用SC-35检查剪接体组织，量化区室面积和圆形度。在表达KRAS G12D的HPNE细胞中，平均剪接体面积在24小时后增加31%，并在48小时保持升高，总增幅达39%。G12R表达引发延迟和减弱的响应，在24小时仅增加16%，在48小时总增幅为21%。对SC-35圆形度的分析揭示了随时间推移剪接体架构的细微但可重复的重组。G12D诱导后，圆形度逐渐下降，从基线平均值0.58降至24小时的0.57和48小时的0.56，表明核斑点的结构复杂性增加。相比之下，G12R诱导与圆形度的较小降低相关，从基线0.58降至24和48小时的0.57，没有进一步进展。这些测量表明，在48小时，G12D驱动剪接体区室额外扩张18%，支持更强大和持续的剪接体组织重塑。总体而言，定量成像表明KRAS突变差异性地影响早期核组织。KRAS G12D在核大小、形状和亚核区室结构方面表现出显著变化，而KRAS G12R在这些特征上显示出更有限和延迟的重塑。这些发现确立了核组织的变异特异性差异，并促使进一步在更高空间分辨率下检查核架构。
2.4. KRAS G12D和G12R差异性地塑造体积核架构
为将核分析扩展到平面测量之外，我们采用高分辨率转盘共聚焦显微镜生成了核和亚核区室的深度分辨体积重建。这种方法能够评估整个核体积的核重塑，并允许与二维成像识别的模式进行直接比较。
在表达KRAS G12D的HPNE细胞中，平均核体积在基线时为823.0 μm3，24小时后适度下降至762.2 μm3（-7.3%），48小时后为773.3 μm3（-6.0%）。尽管这些变化未达到统计显著性，但朝向体积压缩的趋势与二维分析检测到的核面积减少平行，支持G12D诱导后一致的核凝聚。相对于G12D，表达KRAS G12R的细胞在基线时显示出更大的核体积，在24小时保持稳定，并在48小时后显著增加至1012.0 μm3（+10.2%）。
为进一步表征整个核体积的核形状，我们量化了核球度作为圆形度的三维类比。核球度在G12D诱导后逐渐增加，从基线0.68升至24小时的0.71，并进一步升至48小时的0.79，表明进行性核圆化。G12R表达未显著改变球度，在所有时间点均接近基线。因此，核球度在G12D和G12R之间出现分歧，强化了变异特异性差异。
体积分析随后扩展到核仁区室，以确定KRAS驱动的核组织变化是否伴随亚核架构的改变。使用核仁素和原纤维蛋白量化核仁体积，以评估整个核体积内不同的核仁区域。在表达KRAS G12D的细胞中，核仁素定义的核仁体积显著增加，24小时后上升71%，48小时相对于基线达到95%的增加。在同一时间段，原纤维蛋白定义的体积在24小时减少11%，在48小时恢复至基线。
在表达G12R的细胞中出现了不同的模式。核仁素体积在24和48小时均未改变，而原纤维蛋白体积在24小时适度增加14%，并在48小时恢复至基线。与二维结果一致，体积分析证实了G12D诱导后的核仁扩张，并进一步揭示了区室特异性重组而非均匀扩大。相比之下，G12D仅表现出适度且短暂的核仁重塑。
鉴于KRAS G12D下游识别出的显著核仁重组，我们接下来确定核架构的变化是否扩展到其他RNA相关的核区室。为此，我们使用SC-35标记检查了剪接体区室在整个核体积内的体积组织。KRAS G12D诱导后，SC-35体积显著增加，24小时后上升60%，48小时后相对于基线进一步升至71%。这种扩张伴随着球度的下降，从基线0.86降至24小时的0.80和48小时的0.81，反映了改变的剪接体斑点组织。
G12R表达产生更受限制的响应。SC-35体积适度增加，24小时后增加17%，48小时后增加12%，而剪接体球度从基线0.82轻微增加至24小时的0.84和48小时的0.85。因此，KRAS G12D驱动剪接体区室相对于G12R额外扩张59%，并伴随球度下降，反映了改变的斑点几何形状。
总体而言，体积成像通过揭示变异特异性核变化如何在整个核体积内组织，从而完善了二维分析识别的差异。KRAS G12D与核几何的协调改变、区室特异性核仁重组以及剪接体结构的持续扩张相关，而KRAS G12D保持相对稳定的架构，仅进行有限的亚核调整。这些深度分辨测量表明，KRAS突变背景不仅影响早期核重塑的幅度，还影响其空间组织，方式与之前定义的转录和蛋白质组程序一致。
2.5. 大分子架构揭示核亚区室的突变特异性重组
为在更高空间分辨率下检查核重塑，我们使用三维超分辨率显微镜可视化KRAS激活后核亚区室的大分子组织。在24和48小时进行单细胞STED成像，聚焦于根据前述体积分析中为每个KRAS变异体识别的核仁表型选择的代表性核。
在0小时，G12D和G12R核均显示几个圆形、轮廓光滑的核仁素阳性结构域，每个区室内有清晰分离的原纤维蛋白点，与有组织的核仁亚区室一致。到24小时，两种突变体都显示核仁素结构略微扩大且更不规则，在G12D中，原纤维蛋白信号看起来不那么清晰，并开始在最亮的核仁素区域内聚集，而在G12R中，点聚集但仍更小且分离更明显。到48小时，G12D核仁明显更细长和扩大，原纤维蛋白信号广泛散布在每个核仁素定义的区室中，而G12R核仁保持相对圆形，细长有限，原纤维蛋白仍集中在核仁素密集区内更紧凑的焦点中，反映了随时间推移更受限制的核仁重塑。
剪接体组织显示出类似的突变依赖性差异。在基线，SC-35阳性斑点小而稀疏地分布在整个核质中。G12D诱导后，斑点数量和体积在24小时均增加，形成分布在核内的更大组装体。到48小时，这些结构呈现为多个相邻焦点组成的密集簇，表明活性剪接结构域广泛重组。这种模式与多个剪接体亚基的协同聚集一致，而非单个斑点的均匀扩大。在G12R表达下，剪接体架构在24小时保持相对稳定，在48小时可见单个SC-35阳性焦点的适度扩张，表明相对于G12D重组有限。
在纳米级分辨率下，超分辨率成像将之前识别的转录、蛋白质组和体积差异置于一个连贯的架构框架中。核仁素碎片化、原纤维蛋白空间分散以及SC-35阳性斑点聚集等结构特征例证了与KRAS G12D激活相关的协调核重组程序。相比之下，在KRAS G12R下保留的紧凑核仁组织和有限的剪接体重排反映了一种更稳定的核状态。这些收敛的结构特征共同表明，KRAS突变背景在激活后早期被转化为不同的核组织状态，将变异特异性信号与早期胰腺上皮转化期间核区室的空间模式联系起来。
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