《Pathogens》：Genetic Diversity and Novel Lineages of Anaplasma, Ehrlichia, and Coxiella-like Endosymbionts in Ticks from a Forest Ecosystem in Northeastern China
Qingzhu Huang,
Zhongqiu Teng,
Miao Lu,
Yuqing Cheng,
Xincheng Qin,
Lupeng Dai,
Junrong Liang,
Tian Qin and
Jianguo Xu
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本综述通过分子检测和系统发育分析，系统评估了中国东北森林生态系统中蜱类携带的多种细菌性病原体（如Anaplasma、Ehrlichia和Coxiella-like endosymbionts）的遗传多样性。研究发现，在黑龙江牡丹江火山口国家森林公园采集的三种蜱（Haemaphysalis japonica、Hae. concinna和Ixodes persulcatus）中，检测到Anaplasma bovis具有种内遗传变异，鉴定出一种潜在的新型无形体谱系，并表征了两个基因型不同的埃立克体谱系和两个蜱相关的柯克斯体样共生菌谱系。这些发现不仅丰富了我们对蜱传细菌多样性的理解，也为后续的流行病学和分类学研究提供了重要的分子基础。
1. 引言
蜱是全球范围内最重要的吸血节肢动物之一，是影响人类和动物健康的一系列细菌性病原体的高效传播媒介。蜱媒细菌病原体主要包括无形体属（Anaplasma）、埃立克体属（Ehrlichia）、立克次体属（Rickettsia）、柯克斯体属（Coxiella）和疏螺旋体属（Borrelia）的成员，其中许多是全球新发或再发蜱媒疾病的病因。由于其广泛的地理分布以及涉及野生动物、家畜和人类的复杂地方性传播周期，蜱媒疾病构成了一个持续的公共卫生问题，尤其是在森林生态系统和野生动物宿主丰富的地区。
无形体科（Anaplasmataceae）的成员，包括无形体属和埃立克体属，是革兰氏阴性专性细胞内细菌，主要通过硬蜱和脊椎动物宿主之间的传播循环在自然界中维持。几种无形体属细菌在兽医和医学上具有重要意义，可引起家畜的重要经济损失性疾病以及人兽共患感染。其中，Anaplasma bovis是一种单核细胞嗜性物种，已在非洲、亚洲和南美的牛和其他反刍动物中被广泛检测到，感染常与发热、贫血、生产力下降和偶发性死亡相关。尽管动物感染A. bovis通常无症状，但越来越多的证据表明该病原体也具有人畜共患潜力，近年来已有零星的人类感染病例报告。
埃立克体属属于无形体科，目前包括几个公认的物种，可导致人类和动物的埃立克体病。先前的研究表明，埃立克体物种广泛分布于欧洲、亚洲和北美的蜱中，并且在自然蜱种群中也检测到多种未分类的埃立克体变异株。在亚洲，已在硬蜱属和血蜱属蜱中鉴定出多种埃立克体样细菌，凸显了该地区该属细菌的大量但尚未完全表征的多样性。
除无形体科外，柯克斯体属（Coxiellaceae科）包括致病性物种，如Q热病原体Coxiella burnetii，以及一大群与蜱相关的柯克斯体样共生菌（CLE）。尽管CLE通常被认为对脊椎动物宿主无致病性，但先前的研究表明它们在硬蜱属蜱中广泛存在，并表现出显著的遗传多样性。然而，关于自然蜱种群中CLE的多样性和分布的信息仍然有限，尤其是在蜱和野生动物宿主丰富的森林生态系统中。
东北亚地区森林覆盖广泛，野生动物资源丰富，为蜱和蜱媒病原体提供了适宜的生态条件。然而，与中国其他地区相比，对东北森林生态系统蜱中无形体、埃立克体和柯克斯体的系统分子调查研究仍然有限，该地区这些细菌的遗传多样性仍未得到充分了解。因此，本研究旨在利用分子检测和系统发育分析方法，调查中国东北森林生态系统中采集的蜱体内无形体、埃立克体和柯克斯体样共生菌的存在情况和遗传多样性。
2. 材料与方法
2.1. 样本采集与处理
在2025年4月至5月期间，采用标准的布旗法在黑龙江省牡丹江市火山口国家森林公园进行了蜱的采集。采集到的蜱在光学显微镜下使用分类学检索表进行形态学鉴定。采集后，将蜱饲养在人工气候培养箱中，直至提取核酸。为减少外部污染，每只蜱依次用75%乙醇和磷酸盐缓冲盐水清洗三遍，晾干后加入0.3 mL PBS缓冲液。使用Mixer MM 400进行个体匀浆。总基因组DNA使用DNeasy Blood & Tissue Kit按制造商说明进行提取，用100 μL AE缓冲液洗脱，并于4°C保存。每批次提取均设立阴性对照。DNA提取、PCR扩增和产物分析在物理分隔的实验室进行，以避免交叉污染。
2.2. PCR检测与关键基因扩增
为确认蜱种分类，随机选择部分蜱，并使用LCO1490和HCO2198引物对线粒体细胞色素氧化酶I基因进行测序和分析。采用巢式PCR扩增16S rRNA基因的保守区域，用于蜱样本中无形体、埃立克体和柯克斯体样共生菌的分子筛查。所有PCR反应均包含阴性对照和阳性对照。为进一步表征阳性样本，从代表性的无形体和埃立克体阳性样本中扩增了部分柠檬酸合酶基因、60 kDa热休克蛋白基因和更长的rrs基因片段。对于柯克斯体阳性样本，则扩增了groEL、23S rRNA、rpoB和dnaK基因。PCR扩增在SensoQuest LabCycler Standard P PCR系统上进行。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物后，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向Sanger测序。
2.3. 遗传与系统发育分析
使用Lasergene软件包中的SeqMan程序对测序结果进行组装和校对，以获得高质量的共有序列。通过NCBI的BLASTn算法鉴定同源序列。使用单个基因序列和串联序列进行系统发育分析。组装好的基因序列按照rrs、groEL、gltA的顺序串联用于无形体和埃立克体分析，按照rrs、23S rRNA、dnaK、groEL、rpoB的顺序串联用于柯克斯体分析。此外，从GenBank获取了来自不同菌株的各种基因参考序列，提取扩增区域并按顺序串联。使用MEGA 11.0中的Clustal W进行多重序列比对，并使用最大似然法在最佳替换模型下构建系统发育树，通过1000次自举重复评估分支支持度。代表性序列已提交至GenBank数据库。
2.4. 统计分析
计算每种蜱的病原体检出率，并使用Clopper-Pearson方法估计95%置信区间。使用卡方检验或Fisher精确检验比较不同蜱种之间的检出率差异。所有统计分析在IBM SPSS Statistics 25.0中完成。
3. 结果
3.1. 样本采集
在牡丹江火山口国家森林公园的植被上共采集了821只成蜱。根据形态特征，这些蜱属于2个属的3个物种：日本血蜱、嗜群血蜱和全沟硬蜱。通过COI基因序列分析进一步验证了形态鉴定结果。总体而言，日本血蜱占主导地位，其次是嗜群血蜱和全沟硬蜱。系统发育分析表明样本间存在较高的遗传多样性。
3.2. 无形体的检测与表征
对821份蜱样本的分子筛查检测到两种无形体类群：Anaplasma bovis和一个独特的无形体基因型。A. bovis仅在嗜群血蜱中检测到，而该MDJ菌株在一个全沟硬蜱个体中被鉴定出。
从A. bovis阳性样本中获得的所有rrs序列完全相同。这些序列与来自中国和日本的反刍动物及野生动物中先前报道的A. bovis序列表现出高度的核苷酸相似性。基于gltA和groEL基因的差异对A. bovis阳性样本的进一步表征揭示了两种不同的基因型：Type 1和Type 2。在gltA和groEL基因的系统发育分析中，两种基因型始终位于A. bovis相关分支内，其中Type 2与公认的A. bovis菌株聚在一起，而Type 1形成一个独特但密切相关的亚系。基于rrs、gltA和groEL序列构建的串联系统发育树中，两种基因型在强烈的统计支持下聚集在A. bovis谱系内。
此外，从一个全沟硬蜱个体中鉴定出一个遗传上不同的无形体基因型。该MDJ菌株的rrs基因序列与来自日本和中国的梅花鹿及蜱中检测到的几种未培养无形体序列表现出高度同源性。然而，与已验证的无形体物种相比，gltA和groEL基因的相似性较低，表明蛋白编码基因存在显著差异。基于rrs、gltA和groEL基因的多位点系统发育分析一致地将MDJ菌株与克隆1相关序列放在一起，但与公认的无形体物种分开。这些结果表明，MDJ菌株属于先前在日本报道的一种未培养的无形体谱系，而不是任何当前已验证物种的变体。
3.3. 埃立克体的检测与表征
在本研究中，在嗜群血蜱和日本血蜱中均检测到埃立克体序列。共鉴定出20个阳性样本。基于rrs、gltA和groEL基因的多位点序列比较，这些序列一致地分为两种遗传类型。
BLASTn分析显示，两种类型的rrs基因与先前在俄罗斯和中国蜱中报道的未培养埃立克体序列具有高度同源性。具体来说，Type 1与埃立克体尤因变种具有高相似性。对于gltA基因，序列同源性在96.4%至97.7%之间。类似地，groEL基因分析显示，Type 1和Type 2与未培养埃立克体序列的相似性很高。尽管rrs序列与公认的埃立克体物种表现出高度相似性，但系统发育分析显示，这两种类型形成了独立于公认埃立克体物种的支系。这种拓扑位置在多位点系统发育重建中保持稳定，表明它们代表了埃立克体属内遗传上可区分的谱系，而不是已确认的新物种。
3.4. 柯克斯体的遗传与系统发育分析
在本研究中，蜱样本中检测到两种不同的CLE序列类型。基于rrs、23S rRNA、dnaK、groEL和rpoB五个基因片段进行了多位点序列比较和系统发育分析。
BLASTn分析显示，Type I的rrs序列与先前在俄罗斯和中国的血蜱属蜱中报道的蜱相关柯克斯体科序列表现出极高的核苷酸相似性。Type II的rrs序列与来自俄罗斯嗜群血蜱的柯克斯体科细菌RFE03具有高相似性。在23S rRNA基因上，Type I与参考柯克斯体序列显示出高同源性，而Type II则显示出较低的同源性，表明存在更大的遗传差异。对于蛋白编码基因，Type I在dnaK、groEL和rpoB基因上与已报道的蜱相关柯克斯体内共生体具有高核苷酸同源性。相比之下，Type II在几个基因上显示出显著较低的核苷酸同源性，表明其遗传谱系更为独特。
使用rrs、23S rRNA、dnaK、groEL和rpoB数据集重建的系统发育树一致地将这两种序列类型置于蜱相关CLE支系内。在所有基因树中，Type I与先前从血蜱属蜱报道的CLE序列聚集在一起，而Type II形成了一个相邻但独特的谱系。为了进一步提高系统发育分辨率，构建了包含rrs、23S rRNA、dnaK、groEL和rpoB序列的串联数据集。综合分析一致地将两种序列类型定位在蜱相关CLE支系内，并具有强烈的统计支持。Type I和Type II形成了两个相邻但独立的谱系，与先前从血蜱属蜱报道的CLE序列聚在一起。串联树中观察到的分支模式与单基因分析结果一致，进一步支持了它们稳定的遗传分化。
4. 讨论
本研究调查了中国东北牡丹江火山口国家森林公园森林生态系统中蜱相关细菌的情况。在该地区鉴定出三种蜱种，其中以血蜱属占优势。日本血蜱是调查中最常见的蜱种之一。然而，本研究仅关注了在2025年4月至5月期间从单一地点采集的成蜱，因此反映了这个特定时空窗口内的细菌多样性。
A. bovis被认为是反刍动物的病原体，近年来也有零星的人类感染病例报告。在本研究中，A. bovis仅在嗜群血蜱中检测到，检出率为9.3%。在gltA和groEL基因上观察到的遗传差异表明当地A. bovis种群存在种内多样性。在本研究中，我们在全沟硬蜱中发现了一个潜在的无形体新谱系。基于rrs、gltA和groEL基因的系统发育分析一致地将该菌株置于与当前已验证无形体物种不同的支系中。尽管rrs序列与在日本检测到的未培养无形体序列高度相似，但多位点证据支持其系统发育的独特性。由于该谱系仅在单只蜱中检测到，且未检查脊椎动物宿主，其宿主范围、流行率和致病潜力仍然未知。
埃立克体属包括六个公认物种。在本研究中，我们还在嗜群血蜱和日本血蜱中检测到两个遗传上不同的埃立克体谱系。基于rrs、gltA和groEL的基因比对和系统发育分析一致显示，这两种类型形成了独立的支系。尽管这些序列在rrs、gltA和groEL上与埃立克体尤因变种在系统发育上相近，但它们与已验证的埃立克体尤因变种参考菌株明显分开，支持了中国东北蜱中存在遗传上不同的埃立克体谱系。
柯克斯体属包括两个已确认物种、一个候选物种和许多未分类的CLE。在本研究中，在日本血蜱和嗜群血蜱中鉴定出了CLE。基于rrs基因的系统发育分析显示，与先前在俄罗斯血蜱属蜱中报道的柯克斯体序列高度相似。然而，从其他基因推断出的树拓扑结构在聚类模式和参考亲和力方面存在一些差异。这种不一致可能反映了公共数据库中多位点CLE数据的有限性。重要的是，我们从相同的DNA提取物中获得了五个基因的序列，为这些CLE谱系的遗传独特性提供了多位点支持。基于宿主关联和系统发育位置，我们暂时将它们命名为日本血蜱柯克斯体内共生体MDJ株和嗜群血蜱柯克斯体内共生体MDJ株。
蜱通常携带细菌内共生体，这些内共生体是蜱微生物群的广泛组成部分。系统发育分析表明，CLE在更广泛的柯克斯体分支内形成多个亚簇，突显了其进化复杂性。尽管许多CLE被认为是非致病性的，但它们在蜱种群内的生态作用值得进一步研究。
尽管本研究为东北地区蜱相关细菌的遗传多样性提供了宝贵数据，但也应承认几个局限性。采样仅限于一个森林公园，且在一个有限的季节期间进行，这可能影响代表性。此外，仅检查了成蜱，未包括脊椎动物宿主。尽管鉴定出了新的无形体和独特的埃立克体谱系，但无法从现有数据得出关于其流行率、宿主范围或致病性的结论。未来结合更广泛的地理采样、脊椎动物宿主监测、串联多位点分析和基于基因组方法的研究，将为了解其分类学地位和生态意义提供更全面的信息。
5. 结论
总之，本研究为中国东北森林生态系统蜱中无形体、埃立克体和柯克斯体样共生菌的遗传多样性提供了分子证据。A. bovis表现出种内遗传变异，并且基于多位点系统发育分析，在全沟硬蜱中鉴定出一种潜在的新型无形体谱系。此外，还表征了两个遗传上不同的埃立克体谱系和两个蜱相关的柯克斯体样共生菌谱系。这些发现增进了当前对中国东北蜱相关细菌多样性的认识。然而，需要结合扩大的地理采样、脊椎动物宿主调查和基于基因组的分析进行进一步研究，以阐明其分类学地位和流行病学相关性。
