2022-2024年波兰家畜肉毒杆菌中毒的实验室诊断分析与挑战

《Pathogens》：Laboratory Diagnostics of Botulism Cases in Livestock in Poland in 2022–2024 Aleksandra Jarosz, Magdalena Sapa?a and Tomasz Grenda

本文对2022-2024年间波兰上报的13起家畜疑似肉毒杆菌中毒病例进行了系统性实验室诊断分析，结合小鼠生物测定法、传统培养及实时荧光定量PCR等技术，揭示了肉毒毒素C型是多数动物病例的主要病因，并首次在波兰发现由D/C嵌合变体毒素引起的牛病例，强调了在高异质性的肉毒梭菌背景下实验室诊断的关键作用与复杂性。

肉毒杆菌中毒是一种由厌氧产孢的肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的肉毒神经毒素(BoNTs)所引起的神经麻痹性疾病，可影响人类及野生动物和家畜。该病在全球范围内正成为一个日益严重的问题，主要因其导致的高动物死亡率和巨大经济损失。由于其临床症状非特异性，难以明确归因，使得实验室诊断在确认疾病中扮演着关键角色。本文旨在详述2022年至2024年间波兰家畜中疑似肉毒杆菌中毒病例的实验室诊断过程，并探讨其中面临的挑战。

材料与方法

本研究分析的样本材料由波兰国家兽医研究所(NVRI)在2022至2024年间接收，涉及全部13起上报的疑似家畜肉毒杆菌中毒病例。样本类型多样，包括肝脏、血清、消化道内容物、饲料、粪便、垫料以及饮水线中的水样，共计42份。多数病例涉及家禽（鸡和火鸡），少数涉及水貂和牛。诊断主要采用了三种方法：首先，对选定血清样本进行了小鼠生物测定法(MBA)检测，通过观察小鼠出现便秘、渐进性肢体麻痹、呼吸困难及“蜂腰”等症状来判定毒素活性，并通过血清中和试验进行毒素分型确认。其次，采用了传统培养方法，将样本接种于TPGY液体培养基并在厌氧条件下培养，随后在Willis-Hobbs和FAA琼脂培养基上分离疑似菌落，观察其形态及脂解等特性。最后，利用分子生物学方法，从培养物或菌落中提取DNA，通过实时荧光定量PCR技术检测编码肉毒毒素原毒素非血凝素成分的通用基因ntnh，以及针对动物常见毒素类型的bont/C、bont/D等特异性基因，以确定产毒潜力。

结果

在研究的三年期间，共分析了13起疑似病例，其中10起（约77%）通过实验室检测得到确认。大多数确诊病例的病原被鉴定为肉毒毒素C型。在牛病例中，则首次在波兰鉴定出由BoNT D/C嵌合变体引起的肉毒杆菌中毒。就检测样本类型而言，肝脏和饮用水样本的阳性检出率最高，而消化道内容物、饲料和粪便样本的检测结果多为阴性。

在分子检测方面，ntnh基因在36份样本中的18份（50%）中呈阳性，主要分布于肝脏、饮用水、消化道和饲料样本中。通过培养，从样本中分离出11株疑似肉毒梭菌菌株，PCR证实这些菌株均携带ntnh和bont基因，具备产毒遗传潜力。小鼠生物测定法应用于6起家禽病例的血清样本，其中3份（50%）呈现阳性反应，并经血清中和试验确认为C型毒素。研究还发现，疑似病例在温暖季节（夏季和早春，平均气温16.9–20.8°C）和寒冷季节（冬季，平均气温-0.3°C至5.7°C）均有报告，表明肉毒杆菌中毒可能以经典中毒和肠道感染两种形式在不同气候条件下发生。

讨论

本研究展示了在波兰家畜中诊断肉毒杆菌中毒的实践。尽管病例数量有限，但代表了该时期全国所有经正式调查的疑似病例。诊断过程凸显了结合多种方法的必要性：分子生物学方法（PCR）可高灵敏度地检测多种样本基质中的毒素基因，而小鼠生物测定法(MBA)则能直接证实血清中活性毒素的存在，二者互补为临床和流行病学分析提供依据。然而，诊断面临诸多挑战，包括肉毒梭菌菌株的高度异质性、特定培养的困难，以及在分析后期可能丧失产毒能力等。本研究中肝脏样本的高检出率与已有研究结论一致，表明肝脏是诊断肉毒杆菌中毒的有效样本。而饮用水样本的高阳性率则提示其可能作为孢子载体，在农场环境污染传播中起作用，饮水系统的污染可能源于粪便或垫料的接触。

从流行病学角度看，C型毒素在家禽和水貂病例中占主导地位，这与已知的宿主关联性一致。在牛病例中发现的D/C嵌合变体则是一个值得关注的发现，文献提示此类情况可能与农场生物安全漏洞（如受污染禽类粪便的交叉污染）有关。病例在冷暖季节均有发生，说明不能仅凭环境温度来简单预判风险，疾病发生形式（摄食预成型毒素的经典中毒与肠道内产毒的感染型中毒）可能在不同条件下主导疫情。在集约化生产系统，特别是家禽和毛皮动物养殖场，高密度饲养和有机物的积累为孢子存活创造了条件。诸如啄食垫料、食粪癖等动物行为，以及可作为毒素传播媒介的昆虫，都增加了疾病传播风险。

结论

肉毒杆菌中毒对全球畜牧业构成持续威胁，其非特异性临床症状使得实验室诊断至关重要。诊断可依托被视为“金标准”的小鼠生物测定法、传统培养方法以及旨在检测肉毒梭菌或其产毒基因的分子生物学方法。本项针对2022-2024年波兰13起家畜疑似病例的诊断研究，成功确认了其中大部分病例，并明确了主要致病毒素类型，包括首例报道的牛D/C嵌合变体毒素中毒。诊断过程复杂，亟需对样本处理和实验室程序进行标准化。研究结果强调了在畜牧业，特别是集约化养殖场，实施严格的生物安全措施（如有效清洁消毒、控制饲料储存条件、妥善管理垫料、快速移除动物尸体等）对于降低肉毒杆菌中毒暴发风险的根本重要性。