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本研究创新性地利用T7噬菌体展示平台递送美洲钝眼蜱的全抗原库，在牛体内诱导了针对蜱唾液蛋白的免疫应答。ELISA和Western blot证实抗体可识别多种天然唾液蛋白。该疫苗可显著降低蜱的吸血效率和繁殖成功率，幼虫孵化率从对照组的54%降至4%，为开发基于多价抗原库的蜱疫苗提供了高效、可扩展的新策略。
引言
蜱虫及其传播的疾病对公共卫生和兽医健康构成重大挑战，在全球范围内给畜牧业造成巨大经济损失。目前，针对大多数蜱传病原体尚无有效疫苗，防控主要依赖杀螨剂，但广泛出现的抗药性种群威胁了其长期有效性。因此，开发替代性的蜱虫控制策略迫在眉睫。其中，通过免疫宿主动物来阻断蜱虫吸血，被认为是最具可持续性和前景的方法。这一概念源于观察发现，重复的蜱虫侵染可诱导强烈的免疫应答，从而显著损害后续的蜱虫吸血和病原传播。此前，针对微小牛蜱的疫苗Bm86的商业化验证了抗蜱免疫的潜力，但其不稳定的效力也凸显了开发更可靠、更有效替代方案的必要性。
本研究旨在评估利用T7噬菌体展示系统递送cDNA表达文库免疫牛，是否能诱导针对蜱虫的保护性免疫。T7噬菌体平台的关键优势在于能够在外壳表面呈递外源抗原，从而直接与宿主免疫系统相互作用，且其不复制，安全性高。本研究的核心是验证利用该平台制备的美洲钝眼蜱噬菌体展示全抗原库，能否在牛体内诱导特异性抗蜱免疫应答，从而损害蜱虫吸血效率并抑制其幼虫孵化。
方法
本研究遵循了经动物伦理委员会批准的实验程序。共使用十头年龄匹配的荷斯坦小公牛。使用的蜱虫购自专业实验室。实验的核心材料是先前构建的，分别从在兔体上吸血24小时（雄性）和96小时（雌性）的美洲钝眼蜱提取cDNA制备的T7噬菌体展示表达文库。本研究将这些文库扩增、纯化，并通过添加Triton X-114去除内毒素。将纯化后的雄性和雌性蜱虫噬菌体展示文库等量混合，制成“全抗原库鸡尾酒”。
疫苗接种分两轮进行。第一轮评估了添加或不添加佐剂（Montanide? ISA 61 VG）的效果。每组两头牛，分别接受佐剂对照、噬菌体库加佐剂、噬菌体库不加佐剂（仅用SM缓冲液）的免疫。第二轮研究旨在验证首轮发现，将四头新牛分为佐剂对照组和噬菌体库加佐剂组。免疫通过肌肉和皮内注射在颈部附近五个位点进行，初免和加强免疫间隔三周。
通过ELISA和Western blot分析评估免疫原性。ELISA使用噬菌体展示抗原、从在不同吸血时长的蜱虫唾液腺提取的天然蛋白以及重组蜱唾液蛋白作为包被抗原，检测牛血清中的IgM、IgG或纯化IgG。Western blot则用于进一步确认纯化IgG对重组唾液蛋白的特异性识别。从牛血清中纯化的IgG也用于这些分析。
在加强免疫两周后，用美洲钝眼蜱成虫攻击免疫和对照牛。通过测量雌蜱附着率、饱血时间、饱血体重、卵块重量、卵块转换率以及幼虫孵化率等参数，评估免疫对蜱虫吸血和繁殖效率的影响。所有数据使用GraphPad Prism 10进行统计学分析。
结果
3.1. 牛免疫T7噬菌体展示的全蜱抗原可诱导针对噬菌体展示蜱抗原和天然蜱唾液腺蛋白的特异性抗体
研究首先评估了免疫应答是针对T7噬菌体展示的蜱抗原本身，而非噬菌体骨架。ELISA分析显示，与仅接种佐剂的对照牛相比，接种T7噬菌体展示蜱抗原库（无论是否添加佐剂）的牛，在初免后三周产生了显著升高的IgM水平（超过四倍）。而针对空噬菌体的IgM反应性则与背景水平相当，证实了应答是针对T7噬菌体展示的蜱蛋白。
接下来对IgG反应的评估表明，与佐剂对照或空噬菌体颗粒相比，免疫牛产生了强烈的针对T7噬菌体展示蛋白的IgG应答。值得注意的是，将免疫原与佐剂共同配制对于获得高IgG滴度至关重要。虽然初免时各组IgG水平相似，但加强免疫后及蜱虫攻击前，佐剂组免疫牛的IgG水平显著升高，约是未加佐剂组的两倍。这些观察结果在第二轮免疫中得到了重现。
此外，研究证实了牛抗T7噬菌体展示抗原的抗体能够识别天然蜱唾液腺蛋白。这些抗体特异性地与从在牛体吸血24、48、72和96小时的蜱虫唾液腺提取的蛋白发生反应。与针对T7展示抗原的应答一致，佐剂组免疫牛也产生了针对天然唾液腺蛋白的强IgG反应性。在蜱虫攻击后，所有免疫组的IgG水平进一步升高，显示出强烈的回忆性免疫记忆反应。
3.2. 用T7噬菌体展示的全蜱抗原免疫牛可诱导针对重组表达的蜱唾液蛋白的抗体
通过Western blot和ELISA对重组表达的美洲钝眼蜱唾液蛋白的分析证实，牛针对T7噬菌体展示蜱抗原产生的抗体，能够特异性识别在蜱虫吸血期间注入宿主的蜱蛋白。研究评估了15种已知在吸血过程中分泌的重组蜱唾液蛋白。斑点印迹分析显示，从免疫牛血清中纯化的IgG可识别其中13种重组蛋白。从免疫牛的免疫前血清和对照牛蜱虫攻击后血清中纯化的IgG对这些重组抗原几乎没有反应性，证明了特异性。这些抗体与多种唾液蛋白发生强反应，包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、钙网蛋白、血色素脂蛋白、AV422抗原、几丁质酶、组胺释放因子、细胞外基质金属蛋白酶诱导剂和羧肽酶抑制剂等。这些发现证实，观察到的抗原特异性IgG抗体应答是通过用T7噬菌体展示的美洲钝眼蜱蜱抗原免疫牛而诱导产生的。
ELISA进一步揭示了不同重组蜱唾液蛋白之间可变的免疫原性。在测试的抗原中，有6种在佐剂和非佐剂组间引发了相似的IgG水平。值得注意的是，蜱虫攻击后，所有筛查的蛋白抗体水平均有所升高，表明免疫牛体内存在免疫记忆。
3.3. 牛对T7噬菌体展示的全蜱抗原的免疫力可降低蜱虫吸血效率并阻止幼虫孵化
免疫并未影响蜱虫的附着或启动吸血能力，因为对照蜱和免疫牛体表蜱虫的吸血持续时间和饱血时间相近。然而，在免疫牛体表吸血的蜱虫，其血餐效率受到显著损害。作为吸血量指标的饱血体重显著下降：在首轮试验中，对照蜱为1.144±0.047克，而在佐剂疫苗免疫牛体表吸血的蜱降至0.9252±0.0298克，在非佐剂组降至0.9576±0.03407克。第二轮试验也观察到类似趋势。虽然统计上不显著，但在免疫牛体表吸血的蜱虫产卵量较小，且血餐转化为卵的效率未受影响。最重要的是，这些蜱虫产下的卵大部分无活性，仅有4%至7.5%孵化成幼虫，与对照组54%的孵化率形成鲜明对比。
讨论
本研究通过倡导利用T7噬菌体展示系统进行多抗原递送的新策略，推进了抗蜱疫苗的开发。抗蜱免疫的概念源于自然感染的动物通过反复接触蜱唾液蛋白而获得可破坏蜱虫吸血和防止病原体传播的免疫力。本研究证实，T7噬菌体展示系统可用于递送多种蜱唾液抗原，从而不利地影响蜱虫完成其生命周期的能力。
本研究的核心发现是，用展示蜱源性抗原的T7噬菌体免疫，会引发主要针对蜱蛋白而非噬菌体结构成分的强效特异性免疫反应，这凸显了T7噬菌体展示系统作为疫苗递送平台的潜力。此外，数据显示T7展示的抗原能够诱导典型的免疫反应，包括早期的IgM反应和随后的IgG类别转换。更重要的是，由T7展示抗原引发的免疫反应能够识别天然的蜱唾液蛋白，表明关键的抗原表位在展示过程中得以保留。
本研究观察到，在免疫牛被蜱虫攻击后抗体滴度升高，这为T7噬菌体展示蜱抗原引发了有效的免疫记忆提供了有力证据。攻击后增强的抗体反应表明，在吸血过程中引入的天然蜱唾液蛋白被记忆B细胞识别，从而引发了快速、放大的免疫反应。
免疫的主要目标——破坏蜱虫吸血和繁殖——在本研究中得以实现。用T7噬菌体展示的美洲钝眼蜱蜱蛋白库免疫牛，显著降低了血餐效率和繁殖成功率。在免疫牛体表吸血的蜱虫摄入的血量减少，产卵量下降，且关键的是，所产的卵基本无活性，孵化失败率超过95%。这种近乎完全的卵孵化失败具有重要意义，因为多种重要的蜱传病原体（如瑞氏立克次体、劳氏疏螺旋体、牛巴贝虫等）可经卵垂直传播。因此，通过接种T7噬菌体展示的全蜱抗原来阻止幼虫孵化，可以扰乱这些病原体的传播循环，为蜱及蜱传疾病的综合防控提供一种可持续的新策略。
需要承认本研究存在一些局限性。首先，未进行剂量优化以确定T7噬菌体的最有效免疫剂量。其次，研究中使用的T7噬菌体展示文库来源于在兔体吸血的蜱虫cDNA，而蜱虫的基因和蛋白表达具有宿主依赖性，这或许解释了为何免疫未能阻止蜱虫的附着和启动吸血。此外，文库构建自附着后24和96小时的蜱虫，而蜱唾液蛋白表达在整个吸血过程中是高度动态变化的，因此诱导的免疫应答可能主要针对这些特定时间点表达的蛋白质。尽管如此，本研究为利用T7噬菌体展示系统递送由蜱唾液蛋白组成的多价疫苗提供了一个实用框架，该策略模拟了反复遭受蜱侵染的牛所获得的天然、广谱免疫力，为未来的蜱疫苗开发提供了有希望的新方向。
