《Journal of Virology》：Repression of EEF1D by KSHV RTA promotes viral lytic reactivation
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本研究揭示卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）调控宿主免疫逃逸的新机制。研究发现宿主延伸因子EEF1D是抑制病毒裂解性再激活的未知因子，而病毒主调控因子RTA通过两种互补机制（泛素蛋白酶体降解和DNMT3A依赖的转录抑制）拮抗之。其中，转录因子PATZ1是RTA-DNMT3A复合物招募至EEF1D启动子、诱导高甲基化并实现沉默的关键桥梁。该工作首次阐明RTA作为转录抑制子的分子通路，拓展了对其功能图谱的认识，并为理解病毒表观遗传调控宿主基因的策略提供新视角。
卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV）是一种γ-疱疹病毒，与包括卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤和多中心卡斯特尔曼病在内的多种人类恶性肿瘤相关。与所有疱疹病毒一样，KSHV可在宿主体内建立终身潜伏感染，并在特定病理生理条件下重新激活进入裂解性复制周期。病毒的复制和转录激活因子（replication and transcription activator, RTA）是调控这一从潜伏到裂解转换的主开关。RTA既是一种强大的病毒转录激活因子，也是一种E3泛素连接酶。尽管已知RTA可调节宿主基因表达，但其具体作用机制仍未完全阐明。
EEF1D与KSHV RTA发生相互作用
本研究始于一个前期发现：真核翻译延伸因子1δ（eukaryotic translation elongation factor 1δ, EEF1D）是RTA的一个潜在结合伙伴。研究人员首先确认了RTA特异性与EEF1D的长亚型（647个氨基酸）相互作用，而非其短亚型。通过免疫共沉淀（Co-IP）实验，在HEK293T细胞中验证了外源性表达的HA-RTA与Flag-EEF1D能够特异性结合，并且通过GST pull-down实验证明了两者之间的相互作用是直接的。免疫荧光实验进一步显示，当与RTA共表达时，原本主要定位于细胞质的EEF1D会被招募到细胞核中，与RTA发生显著的共定位。更重要的是，在KSHV感染的细胞系（iSLK.RGB、BCBL1和BC3）中诱导裂解性再激活后，内源性免疫共沉淀实验证实了内源的RTA与内源的EEF1D蛋白确实存在相互作用。这些结果共同确立了EEF1D是KSHV RTA的一个新型细胞互作蛋白。
EEF1D过表达抑制KSHV裂解性复制
既然EEF1D与病毒再激活的主调控因子RTA相互作用，研究人员接着探讨了EEF1D是否影响病毒再激活。他们在KSHV潜伏感染的iSLK.RGB细胞中稳定过表达了Flag-EEF1D。当用强力霉素（Dox）诱导裂解性再激活后，与空载体对照组相比，过表达EEF1D的细胞中，代表性病毒裂解基因（RTA、PAN、ORF57、K8.1）以及潜伏基因ORF73的转录水平均显著下调。与此同时，RTA的蛋白水平也明显降低。细胞内和细胞外的病毒DNA拷贝数也因EEF1D过表达而显著减少。最后，用培养上清感染HEK293T细胞的实验表明，来自EEF1D过表达细胞的子代病毒颗粒的感染性更低。为了验证这一现象并非细胞系特异，研究者在另一个KSHV阳性细胞系BCBL1中重复了实验，同样发现EEF1D过表达可抑制TPA诱导的病毒裂解基因表达、RTA蛋白积累、病毒DNA复制和病毒颗粒释放。这些数据表明，外源性过表达EEF1D能够抑制KSHV的裂解性复制。
敲低内源性EEF1D增强KSHV裂解性再激活
为了进一步明确EEF1D在调控KSHV复制中的作用，研究团队在iSLK.RGB细胞中进行了功能缺失分析。通过使用两种特异性的小干扰RNA（siRNA）敲低EEF1D，他们发现EEF1D的敲低显著增强了Dox诱导的病毒裂解基因和潜伏基因的转录，增加了RTA蛋白水平，并提升了细胞内病毒基因组DNA负荷和细胞外病毒颗粒相关的DNA拷贝数。感染实验同样证实，来自EEF1D敲低细胞的培养上清能够感染更多的HEK293T细胞，表明产生了更多具有感染性的子代病毒。在BCBL1细胞中进行TPA诱导的再激活实验也得出了类似结论，即敲低EEF1D促进了病毒DNA的扩增和病毒颗粒的释放。综上所述，内源性EEF1D是KSHV裂解性再激活的一个负调控因子。
KSHV RTA通过下调EEF1D来拮抗这个抗病毒因子
鉴于EEF1D抑制KSHV裂解性复制，研究者假设病毒可能通过下调EEF1D来克服这种抑制。实验发现，在iSLK.RGB和BCBL1细胞中诱导KSHV裂解性再激活后，EEF1D的mRNA和蛋白水平均发生显著下降。这表明病毒再激活本身触发了EEF1D表达的下调。为了探究RTA是否足以介导这种下调，研究者在无KSHV的iSLK细胞（该细胞稳定整合了Dox诱导的RTA表达框）中诱导了RTA表达。结果显示，仅RTA的表达就足以导致内源性EEF1D的mRNA和蛋白水平急剧下降。更重要的是，在诱导RTA表达的同时敲低RTA，能够有效地挽救EEF1D的mRNA和蛋白水平。这些结果证明，RTA是下调EEF1D表达的必要且充分条件。
RTA促进EEF1D泛素化和降解，但mRNA下调是其主要减少原因
由于RTA具有E3泛素连接酶活性，并且与EEF1D直接互作，研究团队探究了RTA是否通过泛素-蛋白酶体途径调控EEF1D的蛋白稳定性。在过表达系统中，RTA能以剂量依赖的方式降低EEF1D的蛋白水平，但不影响其mRNA水平。环己酰亚胺（CHX）追踪实验显示，RTA显著缩短了EEF1D的蛋白半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132处理可以有效阻断RTA导致的EEF1D蛋白下调。泛素化实验进一步证实，RTA能强烈促进EEF1D的多聚泛素化。这些数据表明，RTA通过其E3泛素连接酶活性靶向EEF1D，促进其通过泛素-蛋白酶体途径降解。
然而，在评估该降解途径对总EEF1D下调的贡献时，研究者发现了一个更占主导地位的机制。在iSLK细胞中诱导RTA表达后，MG132处理只能部分恢复EEF1D的蛋白水平（从对照的0.35恢复到0.60），而对已知的RTA蛋白酶体降解底物SMC6则能完全恢复。这提示，虽然RTA介导的蛋白降解确实存在，但在RTA诱导后，EEF1D转录本丰度的显著下调是阻碍其蛋白水平完全恢复的关键限制因素。因此，RTA采用了一种双重干扰机制：一方面通过泛素-蛋白酶体途径直接破坏EEF1D蛋白的稳定性，另一方面通过更显著地下调EEF1D的转录本来从根本上限制其表达。
RTA介导的EEF1D启动子抑制在灵长类γ-疱疹病毒中具有保守性
上述发现表明RTA主要在转录水平抑制EEF1D。鉴于RTA是著名的转录激活因子，研究者深入探索了其作为EEF1D转录抑制因子的可能性。双荧光素酶报告基因实验显示，RTA能显著抑制EEF1D启动子的活性，而这种抑制是特异的，因为已知的RTA反应性启动子（如PAN、ORF57）在相同条件下被激活。剂量反应分析进一步表明，随着RTA表达量的增加，EEF1D启动子活性呈渐进式降低。
由于RTA在γ-疱疹病毒中保守，团队比较了KSHV、恒河猴猴疱疹病毒（RRV）、爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）和小鼠γ-疱疹病毒68（MHV68）的RTA同源蛋白对EEF1D启动子的影响。系统发育分析显示，RRV-RTA和EBV-RTA与KSHV-RTA亲缘关系较近，而MHV68-RTA则较为疏远。功能实验发现，来自KSHV、RRV和EBV的RTA蛋白均能以剂量依赖的方式抑制人EEF1D启动子活性，而MHV68-RTA非但不抑制，反而增强了其活性。这些发现确立了RTA作为EEF1D转录抑制因子的功能，并且该功能在灵长类γ-疱疹病毒中保守，但在鼠源的MHV68中缺失。
RTA介导的抑制需要DNMT依赖的启动子高甲基化
研究接下来探索了RTA抑制EEF1D转录的机制。考虑到启动子DNA甲基化是转录沉默的经典机制，他们检测了RTA是否通过DNA甲基转移酶（DNMT）依赖的启动子高甲基化来抑制EEF1D表达。在iSLK细胞中，用DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-AZA）与Dox共处理，可以完全逆转由RTA诱导导致的EEF1D转录本和蛋白水平的下调，表明这种抑制是DNMT依赖性的。为了直接评估EEF1D启动子的DNA甲基化状态，他们进行了重亚硫酸盐测序PCR（BSP）。结果显示，与未处理的对照相比，单独用Dox诱导RTA表达的细胞，其EEF1D启动子甲基化水平显著增加，表明RTA促进了EEF1D启动子的高甲基化。而Dox与5-AZA共处理则显著降低了启动子甲基化水平。这些结果证明，KSHV RTA通过诱导宿主DNA甲基转移酶活性依赖的启动子高甲基化来抑制EEF1D转录。
DNMT3A特异性介导RTA诱导的启动子高甲基化
哺乳动物细胞中的启动子高甲基化主要由DNMT1、DNMT3A和DNMT3B介导。为了确定具体是哪个DNMT介导了RTA的效应，研究人员在Dox诱导的iSLK细胞中分别敲低了DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。他们发现，敲低DNMT3A（而非DNMT1或DNMT3B）能够有效地恢复EEF1D的转录本和蛋白水平，尽管RTA的表达依然持续。这表明DNMT3A特异性介导了RTA诱导的EEF1D抑制。免疫共沉淀实验进一步显示，RTA优先与DNMT3A相互作用，而不是与另一种从头甲基转移酶DNMT3B。BSP分析证实，敲低DNMT3A能够显著减轻RTA诱导的EEF1D启动子高甲基化。综上，这些结果确定了DNMT3A是RTA招募以实现EEF1D转录抑制的关键甲基转移酶。
PATZ1介导RTA诱导的EEF1D表观遗传沉默
由于EEF1D启动子缺乏经典的RTA结合基序，研究者推测RTA可能是通过细胞辅助因子被招募到启动子上的。通过生物信息学预测，他们筛选出四个在EEF1D启动子区域有结合位点的高置信度候选转录因子：PATZ1、KLF5、KLF15和CTCF。通过双荧光素酶报告基因实验筛选发现，过表达PATZ1或KLF5能显著抑制EEF1D启动子活性，且PATZ1与RTA共表达时具有协同抑制效应。随后的功能实验表明，敲低PATZ1（而非KLF5）能够显著减弱RTA介导的EEF1D启动子抑制。在iSLK细胞中进行的验证实验显示，敲低PATZ1可以有效逆转由RTA诱导导致的EEF1D mRNA和蛋白水平的下调。BSP分析进一步揭示，PATZ1的敲低几乎完全消除了RTA诱导的EEF1D启动子高甲基化。这些数据表明，PATZ1对于RTA介导的转录抑制和启动子高甲基化是不可或缺的。
PATZ1将RTA-DNMT3A复合物招募至EEF1D启动子的特定调控节点
PATZ1是一种具有支架功能的转录因子。研究团队假设PATZ1可能促进RTA-DNMT3A复合物招募到EEF1D启动子。免疫共沉淀实验证实，RTA与PATZ1存在强烈且特异的相互作用，而与KLF5则不结合。进一步的实验证明RTA、PATZ1和DNMT3A可以形成一个三元复合物。在KSHV裂解性再激活的iSLK.RGB细胞中，内源性免疫共沉淀也验证了DNMT3A与RTA和PATZ1的相互作用。
为了确定这个多蛋白复合物是否特异性组装在EEF1D启动子上，他们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验。ChIP-qPCR分析显示，在病毒再激活期间，PATZ1显著富集在EEF1D启动子的特定区域（A、B、C区）。更重要的是，ChIP-免疫印迹分析表明，通过抗体沉淀染色质结合的PATZ1，能够共沉淀出RTA和DNMT3A，证明PATZ1在染色质水平上招募了RTA-DNMT3A抑制复合物。通过瞬时转染Flag-RTA进行的ChIP-qPCR进一步证实，Flag-RTA在启动子上的富集模式与PATZ1相似。这些空间观察表明，RTA-PATZ1-DNMT3A复合物的组装定位于甲基化敏感区域侧翼的特定调控节点。总之，PATZ1作为关键的衔接蛋白，促进了RTA-DNMT3A复合物在EEF1D启动子上的位点特异性招募。
PATZ1是KSHV再激活过程中RTA介导的EEF1D沉默和启动子高甲基化所必需的
最后，研究在经历完整KSHV裂解性再激活的iSLK.RGB细胞中验证了上述机制。结果表明，在病毒再激活过程中敲低PATZ1，能够有效逆转EEF1D mRNA和蛋白水平的下调。BSP分析证实，PATZ1的敲低几乎完全阻断了病毒再激活诱导的EEF1D启动子核心调控区域的高甲基化，使启动子保持在一个以低甲基化为主的状态。这种DNA甲基化的剧减与EEF1D转录的恢复相关联，表明RTA-DNMT3A复合物向染色质的招募在功能上依赖于PATZ1。
总结
本研究首次发现宿主蛋白EEF1D是抑制KSHV裂解性再激活的一个先前未被识别的因子。而病毒主调控因子RTA则通过两种互补的机制来对抗这种抑制：其一，作为次要机制，利用其E3泛素连接酶活性促进EEF1D蛋白的泛素-蛋白酶体降解；其二，也是更为主要的机制，是充当转录抑制子，通过与转录因子PATZ1协作，招募DNA甲基转移酶DNMT3A至EEF1D启动子，诱导其高甲基化，从而实现转录沉默。这项工作揭示了RTA作为宿主基因转录抑制因子的新功能，阐明了一个由“转录因子引导招募”的精巧分子机制，扩展了我们对KSHV如何利用宿主表观遗传装置来克服抗病毒防御、促进自身复制和传播的理解，为疱疹病毒潜伏与再激活的调控网络提供了新的见解。
