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本研究聚焦于脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）这一缺乏有效疗法的神经退行性疾病。针对其致病基因ATXN3突变，研究人员创新性地利用细胞外囊泡（EVs）作为递送载体，构建了装载帕米酰化修饰（Palm）与光裂解连接子（PhoCl）融合的SpCas9/单向导RNA（sgRNA）核糖核蛋白复合物（RNPs）。该策略成功在体外细胞、SCA3患者来源iPSCs及两种动物模型中实现了ATXN3的敲除，为解决CRISPR-Cas9在体递送难题、开发SCA3等遗传病的精准治疗方案提供了极具潜力的新平台。
脊髓小脑性共济失调3型（Spinocerebellar Ataxia Type 3, SCA3），又称马查多-约瑟夫病，是一种由ATXN3基因中CAG三核苷酸异常重复扩增引起的常染色体显性遗传神经退行性疾病。这种突变导致ataxin-3蛋白产生有毒的获得性功能，进而引发蛋白错误折叠、聚集，最终导致小脑、脑干等关键脑区的神经元死亡。目前，针对SCA3尚无能够改变疾病进程的根治性疗法。尽管以CRISPR-Cas9为代表的基因编辑技术为精准敲除致病基因带来了曙光，但如何安全、高效地将这些“分子剪刀”递送至目标组织，特别是难以触及的中枢神经系统，并控制其活性以避免长期存在的脱靶风险，是横亘在从实验室走向临床的巨大障碍。传统递送载体如腺相关病毒（Adeno-associated vectors, AAVs）存在包装容量有限、免疫原性、长期表达编辑酶增加脱靶风险等问题。因此，开发一种能够实现瞬时、高效递送基因编辑工具的新型载体，成为该领域亟待突破的关键。
为此，来自葡萄牙科英布拉大学的研究团队在《Biomaterials》杂志上发表了一项创新性研究。他们巧妙利用人体内天然存在的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为“特洛伊木马”，设计了一套可光控释放的SpCas9核糖核蛋白复合物递送系统，并成功应用于SCA3的疾病模型治疗，为遗传性神经疾病的基因治疗开辟了一条新途径。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：1) 分子克隆与质粒构建：构建了SpCas9与不同囊泡包装序列（帕米酰化信号Palm、跨膜蛋白CD9、CD63）及光裂解蛋白PhoCl的融合表达载体。2) 细胞外囊泡的制备与表征：使用HEK 293T细胞作为生产者细胞，通过差异超速离心法分离纯化EVs，并利用纳米颗粒追踪分析、Western blot、透射电镜等手段对EVs的浓度、大小、形态及标志物进行鉴定。3) 光控释放系统：利用410 nm激光照射，实现PhoCl连接子的裂解，从而在EVs中释放自由的SpCas9。4) 基因编辑效率评估体系：包括基于靶向扩增子测序的Indel（插入/缺失）频率分析、基于纳米荧光素酶（nanoluc）融合蛋白的报告系统、以及Western blot和免疫细胞化学检测内源性ATXN3蛋白表达。5) 疾病模型验证：使用了SCA3患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）、以及过表达突变ATXN3-nanoluc的慢病毒小鼠模型和携带人源全长ATXN3基因（84 CAG重复）的YAC SCA3 84.2转基因小鼠模型，通过脑内立体定位注射进行在体疗效评估。
研究结果
1. 工程化SpCas9 RNP的帕米酰化信号促进其在EVs中的富集
研究人员比较了Palm、CD63和CD9三种序列在促进SpCas9蛋白富集到EVs中的效率。Western blot和定量分析表明，三者均能显著提高EVs中SpCas9的载量，其中Palm-SpCas9的效果与CD9-SpCas9相当。由于Palm序列更小，且棕榈酰化是可逆的翻译后修饰，研究者最终选择Palm-SpCas9进行后续研究。定量计算显示，每个装载了Palm-SpCas9的EV颗粒平均含有约3.66个SpCas9分子。
2. 在Palm-SpCas9中关联可裂解连接子允许光诱导的SpCas9在EVs中释放
为了避免装载了Palm-SpCas9的EVs进入靶细胞后，SpCas9因帕米酰化信号而被错误地导向细胞膜并被重新分泌，研究者在Palm和SpCas9之间插入了一个光裂解蛋白（PhoCl）连接子，构建了Palm-PhoCl-SpCas9。体外实验证实，在410 nm光照下，PhoCl发生裂解，导致SpCas9从Palm基序上释放。对装载了Palm-PhoCl-SpCas9的EVs进行光照处理，能够剂量依赖性地增加自由SpCas9的比例，最高可达40.73%，实现了编辑工具在递送前的可控释放。
3. Palm-PhoCl-SpCas9的表达导致sgRNAs在EVs中共同富集
研究表明，在生产者细胞中共表达Palm-PhoCl-SpCas9和靶向ATXN3的单向导RNA（sgKO.2），能使sgRNA在EVs中的富集水平提高90倍，这很可能是由于在胞质内形成了SpCas9:sgRNA RNP复合体，从而被共同包装进EVs。将装载了RNP的EVs与靶细胞共孵育后，可在细胞内检测到sgRNA，但其水平随时间推移而下降，符合瞬时递送的特征。
4. 光激活的、装载Palm-PhoCl-SpCas9 RNPs的EVs在体外降低ATXN3表达
利用构建的突变ATXN3-纳米荧光素酶报告细胞系，研究人员评估了EVs递送系统的编辑效率。结果显示，经光激活的、装载了Palm-PhoCl-SpCas9:sgKO.2 RNP的EVs，能够将报告信号降低58.57%，效果优于未经光照的对照组，表明光控释放能提高编辑效率。免疫荧光染色进一步证实，经EVs处理的细胞，其内源性ATXN3蛋白水平在传代两周后仍显著降低，证明了编辑效果的持久性。剂量实验表明，编辑效率呈剂量依赖性，最高可降低60.48%的报告信号。
5. 装载Palm-PhoCl-SpCas9 RNP并表达VSV-G的EVs在SCA3患者来源iPSCs和动物模型中介导ATXN3敲除
为提高EVs对神经细胞的递送效率，研究者在EVs表面表达了水疱性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）。将这种经过改造、并装载了Palm-PhoCl-SpCas9:sgKO.2 RNP的EVs，作用于来自SCA3患者（等位基因分别为23和80 CAG重复）的iPSCs，Western blot分析显示，突变型和野生型ATXN3蛋白表达分别平均降低了28.38%和21.21%。在动物模型中，研究者首先在野生型小鼠纹状体注射表达突变ATXN3-nanoluc的慢病毒，建立报告模型，随后注射经光激活的VSV-G EVs。结果表明，注射了装载RNP的EVs的大脑半球，其发光信号比对照半球（注射仅装载SpCas9蛋白的EVs）平均降低34.42%。最后，在更接近人类疾病状态的YAC SCA3 84.2转基因小鼠的小脑中注射该EVs系统，四周后分选GFP+的小脑细胞并进行Surveyor核酸酶 assay检测，发现在靶位点产生了最高达15.4%的Indel，证实了该系统能够在活体内、在表达内源性人源ATXN3的神经细胞中实现基因编辑。
研究结论与意义
本研究成功开发了一种基于细胞外囊泡（EVs）的新型递送平台，用于实现SpCas9:sgRNA核糖核蛋白复合物（RNPs）的瞬时、可控递送，并将其应用于治疗脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）。该平台的创新性主要体现在：1) 利用小型帕米酰化（Palm）基序高效装载SpCas9至EVs；2) 引入光裂解（PhoCl）连接子，实现递送前对SpCas9的可控释放，有望促进其向细胞核转运；3) 利用SpCas9与sgRNA的自然结合，实现sgRNA在EVs中的高效共装载；4) 通过在EVs表面展示VSV-G糖蛋白，提升其对神经细胞的递送效率。
研究在SCA3患者来源iPSCs和两种不同的SCA3动物模型中均验证了该平台的基因编辑疗效，实现了ATXN3基因的部分敲除。这不仅为SCA3这一无药可治的顽疾提供了一种全新的治疗策略概念验证，更重要的是，该系统通过EVs递送预组装的RNP，避免了病毒载体长期表达编辑酶带来的脱靶和免疫风险，体现了更高的安全性。同时，光控释放机制为时空精准控制基因编辑活动提供了可能。尽管目前脑内注射的递送方式在分布范围上存在局限，但该工作系统性地解决了EVs包装、 cargo释放、靶向递送和体内功效验证等多个关键环节，为利用EVs递送CRISPR-Cas9工具治疗包括SCA3在内的单基因遗传病，乃至其他需要瞬时干预的疾病，奠定了一个坚实且有前景的技术平台基础。
