通过模块化共培养工程技术对大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行改造，以实现从葡萄糖从头合成色氨酸（tryptophol）的目标

本研究构建了大肠杆菌-酵母共培养系统，通过代谢工程优化色氨酸合成模块，采用计算设计强化转运蛋白及基因删除策略，提升酵母中色氨酸向色氨酸醇的转化效率。系统优化发酵参数后，在5L生物反应器中实现2.14g/L的高效合成，生产力达0.027g/L/h，创下单源生物合成最高记录，验证了模块化共培养策略在可持续芳香醇生产中的应用。

　　

付振豪|郑家敏|张乐乐|詹建生|白中虎|叶莉

江南大学生物技术学院与教育部工业生物技术重点实验室，中国无锡市蠡湖路1800号，214122

摘要

微生物共培养使得不同物种之间能够实现模块化的分工，为复杂的生物转化提供了坚实的基础。本文建立了一种大肠杆菌（Escherichia coli）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的共培养系统，该系统能够直接从葡萄糖高效地从头合成色氨酸（indole-3-ethanol，简称IET）。上游的大肠杆菌模块通过协同过表达aroG、serA和trpEDCBA基因，实现了l-色氨酸（l-Trp）的过量生产，在含有LB培养基的摇瓶中培养48小时后，l-Trp的浓度达到了1.01克/升。下游的酿酒酵母模块通过增强Ehrlich途径（上调ARO9、ARO10和SFA1基因）、转运蛋白工程（过表达TAT1基因）以及基于基因组模型模拟的UGA1基因删除，显著提高了l-Trp的吸收效率及其向IET的转化效率。基于荧光的群体追踪实验确认了大肠杆菌和酿酒酵母菌群的稳定共存及可调节的竞争关系。通过进一步系统优化接种比和发酵参数，使得在5升生物反应器中80小时内IET的最终浓度达到了2.14克/升（产率：0.027克/升·小时），这是迄今为止从可再生碳源中获得的最高产率。这项工作展示了一种合理的模块化共培养策略，结合了代谢工程、计算设计和过程优化，实现了芳香醇的可持续生物合成。

引言

吲哚-3-乙醇（IET），又称色氨酸，是一种含有吲哚环结构的芳香醇，在食品工业中作为重要的感官和风味化合物（Boban等人，2024年）。在微生物中，IET具有群体感应功能；而在高等生物中，它还表现出神经活性和抗氧化特性（Li等人，2024年）。最近的研究还表明IET具有抗炎潜力：在3T3-L1脂肪细胞中，IET能够下调促炎趋化因子的表达（Niwa等人，2025年）；含有IET的外用制剂能够缓解咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的炎症（Pudgerd等人，2025年）。此外，IET还能诱导U937细胞凋亡，显示出潜在的抗肿瘤效果（Inagaki等人，2007年）。在合成化学领域，通过对IET或其衍生物的羟乙基侧链或吲哚氮进行结构修饰，可以合成具有药理活性的化合物，例如抗偏头痛药物舒马曲坦（Tfelt-Hansen等人，2000年）以及抗肿瘤生物碱physovenine和goniomitine（Palmieri & Petrini，2019年）。因此，IET是一种高价值的生物活性化合物，在食品和制药工业中具有广泛的应用前景。

迄今为止，IET的工业生产完全依赖于化学合成。Fischer吲哚合成法仍然是最常用的方法，在优化的连续流微波条件下，5分钟内即可实现高达95%的产率（Dubhashe等人，2018年）。然而，该方法需要较高的温度，并会产生对环境有害的废料。随着对可持续性的日益重视（Adegboye等人，2021年；Nikolau等人，2008年），微生物发酵已成为IET生物合成的一个有前景的绿色替代方案。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由于其天然的Ehrlich途径而被确立为IET生产的主要微生物宿主（Hazelwood等人，2008年），该途径通过转氨作用、脱羧作用和氧化作用将l-色氨酸（l-Trp）转化为IET。基于这一途径，通过补充外源l-Trp，酵母中的IET浓度可达到266毫克/升（Gong等人，2022年）。在之前的研究中，采用模块化代谢工程策略缓解了途径中的瓶颈，实现了直接从葡萄糖合成IET的产率为1.04克/升（Li等人，2024年）。然而，后续分析表明，酿酒酵母并非氨基酸生物合成的理想宿主（Tang等人，2024年）；其有限的l-Trp通量限制了IET的从头合成。由于传统代谢调控已达到实际极限，进一步改进较为困难。

为了克服单培养系统的局限性，近年来开发了基于微生物联合体的共培养策略（Zhang & Wang，2016年）。这种方法将漫长的生物合成途径划分为专门的模块，并将每个代谢任务分配给最适合的微生物，从而在不同微生物群体之间实现模块化的分工，减轻了单个菌株的代谢负担，同时利用了它们各自的代谢优势（Duncker等人，2021年）。典型的例子包括醋酸发酵：酵母首先将糖发酵为乙醇，随后由醋酸细菌将其氧化（Raspor & Goranovic，2008年），以及利用酿酒酵母和Zymomonas mobilis共同发酵生产生物乙醇（Szambelan等人，2004年）。这些系统共同验证了共培养策略在复杂生物转化中的可行性和效率。

鉴于微生物共培养的优势，我们尝试使用大肠杆菌（Escherichia coli）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）系统来合成IET。由于大肠杆菌已建立起高效的l-Trp生物合成代谢框架，并且在工业规模生产方面具有成熟的潜力（Liu等人，2012年），我们将l-Trp的生成模块分配给大肠杆菌，而将l-Trp转化为IET的模块则保留在酿酒酵母中，因为后者具有天然的、高效的Ehrlich途径（Hazelwood等人，2008年）。通过构建过量生产l-Trp的大肠杆菌菌株和高效生产IET的酿酒酵母菌株，并系统优化接种比和发酵参数，我们建立了一个稳定且高产的共培养系统。结合转运蛋白工程和基于计算模型的方法来预测非直观的基因靶点，这一策略使得在5升生物反应器中IET的产率达到了2.14克/升，这是迄今为止从从头合成途径获得的最高产率。此外，与我们之前使用经过全面工程改造的酿酒酵母开发的单培养系统（Li等人，2024年）相比，本研究的共培养系统生产IET的速度显著更快：在5升生物反应器中仅用80小时就实现了2.14克/升的产率，产率为0.027克/升·小时，基于葡萄糖的产物产率为0.014克/克。相比之下，之前使用工程改造的酿酒酵母的单培养系统在168小时的发酵后仅产生了1.04克/升的IET，产率为0.0062克/升·小时（Li等人，2024年）。因此，这种策略为微生物生产IET提供了一种高效且可持续的方法。

菌株和培养基

本研究中使用的酿酒酵母基础菌株（Entian & K?tter，2007）为BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）（Entian & K?tter，2007），来自我们的实验室菌株库。酵母菌株在含有10克/升酵母提取物、20克/升色氨酸（Oxoid?，英国巴斯ingtoke）和20克/升葡萄糖（Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.，中国上海）的YTD培养基中培养。为了选择整合到酵母基因组中的营养缺陷标记，使用了合成完全培养基（SC培养基）

构建高效生产l-Trp的大肠杆菌菌株

由于大肠杆菌已建立起高效的l-Trp生物合成代谢框架，我们将l-Trp的生成模块分配给大肠杆菌。为了提高l-Trp的合成效率，需要优化从中碳代谢向莽草酸途径和丝氨酸分支的代谢流。先前的研究表明，大肠杆菌中的l-Trp合成受到许多瓶颈的限制，例如（1）前体物质（PEP和E4P）供应不足，（2）莽草酸途径中的强烈反馈抑制

结论

在这项研究中，我们开发了一种模块化的大肠杆菌-酿酒酵母共培养系统，用于从葡萄糖从头合成IET。通过将代谢过程功能性地划分为上游的l-Trp生产菌株和下游的Ehrlich途径工程化酿酒酵母菌株，实现了碳流的高效重新分配和途径平衡。系统性地增强了大肠杆菌中的l-Trp合成能力，并提升了酿酒酵母中对l-Trp的吸收和下游转化效率

作者贡献声明

付振豪：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。郑家敏：方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。张乐乐：实验实施。詹建生：实验实施。白中虎：项目管理、资金争取。叶莉：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、资金争取、数据分析、概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了江苏省研究生研究与实践创新计划（编号KYCX25_2715，资助对象Z.F.）、国家自然科学基金（编号21878124，资助对象Z.B.）以及四川大学科学与工程研究院的研究启动基金（编号H40125096，资助对象Y.L.）的支持。