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脂肽高通量筛选方法比较及验证研究。通过BTB、CPC-BTB、CPC-FL三种方法对17株土壤分离菌的脂肽产量检测，发现CPC-BTB最敏感（B4达64.3μg/ml）且重复性好，而BTB灵敏度最低。验证显示A1株CPC-BTB检测值（41.47μg/ml）显著高于CPC-FL（0.92μg/ml），结合FTIR分析确认CPC-BTB更可靠。
乌特普雷克莎·塔普利亚尔（Utpreksha Thapliyal）| 桑吉塔·内吉（Sangeeta Negi）
印度北方邦普拉亚格拉杰（Prayagraj）莫蒂拉尔·尼赫鲁国家理工学院（Motilal Nehru National Institute of Technology）生物技术系，邮编211004
摘要
脂肽（LPs）是一种高价值、可持续的生物表面活性剂，通过高通量筛选（HTS）方法快速检测产生脂肽的微生物菌株是当务之急。为了评估不同HTS方法的效率，本研究使用了溴百里酚蓝（BTB）检测法、十六烷基吡啶氯化物-溴百里酚蓝（CPC-BTB）检测法和十六烷基吡啶氯化物-荧光素（CPC-FL）检测法进行了比较研究。从15个受油污染的地点收集了土壤样本，并分离出了65株微生物菌株。经过初步筛选并去除重复菌株后，使用三种HTS方法对17株菌株进行了进一步检测。通过比较这些方法的灵敏度（LP浓度）和重复性，并通过检测LP的特性（EI24、ODA、DCA和ST）来验证其效果。各检测方法中的最大LP浓度分别为：BTB检测法为48.75 μg/ml；CPC-BTB检测法为64.3 μg/ml；CPC-FL检测法为37.19 μg/ml。通过确认性测试验证结果后发现，A1菌株在BTB检测法中显示的LP浓度较低（4.42 μg/ml），但在CPC-BTB和CPC-FL检测法中浓度较高，其EI24值为48%，ODA值为5 cm，DCA值为30 s，表面张力（ST）从70 mN/m降低到30 mN/m。这些结果表明BTB检测法的灵敏度相对较低。而在CPC-BTB和CPC-FL检测法中，CPC-BTB的灵敏度和重复性更好，因为B6菌株在CPC-BTB检测法中的LP浓度为41.47 μg/ml，而在CPC-FL检测法中仅为0.92 μg/ml。尽管如此，确认性测试和分子特性分析（如FTIR分析）仍支持CPC-BTB检测法。
引言
脂肽是一种两亲性生物分子，由含有10-18个碳原子的脂质尾部和由5-15个氨基酸组成的肽段构成。它们主要由Bacillus和Pseudomonas属细菌产生，但Streptomyces、Paenibacillus、Burkholderia、Aspergillus和Trichoderma属也具有产生脂肽的能力。由于脂肽具有广谱抗菌、抗真菌和抗癌活性，在工业领域备受重视（Li等人，2021年）。由于其环保、可持续且无毒的特性，脂肽在医疗保健和农业领域以及工业配方中广泛应用（Chen等人，2025年）。Das等人（2023年）从受原油污染的地点分离出两种能够产生烃分解型和脂肽生物表面活性剂的Bacillus菌株，用于去除沥青质。尽管脂肽具有潜力，但其自然产量很低且具有菌株特异性，因此亟需快速高效的检测方法。Zhu等人（2021年）回顾了脂肽的生物合成机制，并对基因控制下的脂肽生产进展进行了深入探讨，但这种方法成本较高。Rangarajan和Clarke（2015年）对生产脂肽的过程参数进行了批判性分析并提出了优化方案，但该方法耗时较长。因此，高通量筛选（HTS）方法成为从大量微生物库中快速识别高效脂肽生产菌株的有效工具。这些方法灵敏度高、节省时间和资源，有助于加速发现和优化。脂肽还作为强效生物表面活性剂，能够降低表面和界面张力，促进乳化作用和生物修复（Sarnaik等人，2020年）。它们的多功能性凸显了开发先进筛选技术的紧迫性。
高通量筛选（HTS）方法是快速识别产生脂肽的微生物的有效手段。Song等人（2010年）开发了一种高效自动化的HTS系统，用于检测分解生物质的酶混合物。为了检测产生脂肽的菌株，选择了三种高通量筛选方法：溴百里酚蓝检测法、十六烷基吡啶氯化物-BTB检测法和CPC-荧光素检测法（Ali等人，2023年）。其中，溴百里酚蓝（BTB）检测法通过颜色变化来识别脂肽合成引起的pH变化，但并非针对脂肽特异。CPC-BTB检测法结合了BTB和十六烷基吡啶氯化物（CPC），形成稳定的复合物，产生可见的蓝绿色菌落；CPC-荧光素（CPC-FL）检测法则利用荧光素染料实现脂肽的荧光检测。与传统方法（如溶血试验，S?b?等人，2023年）相比，这些方法更具特异性、灵敏度和可扩展性，可同时检测多个菌株且所需样本量较少。
一种基于pH值的比色法——溴百里酚蓝（BTB）检测法用于识别产生脂肽的微生物菌株。该检测法基于脂肽与溴百里酚蓝染料的相互作用：在碱性条件下呈现蓝色，在酸性条件下变为黄色（图A.1）。由于其操作简便和快速响应特性，非常适合高通量筛选（Ong和Wu，2018年）。他们对15种微生物进行了HTS检测，发现提取的脂肽浓度范围为150至1200 μg/ml。Dybko和Wróblewski研究了该检测法的机制，发现碱性条件下带负电荷的氨基酸（如天冬氨酸和谷氨酸）会排斥BTB染料的磺酸基团（SO3?），而在酸性条件下，这些氨基酸会与BTB染料的磺酸基团形成氢键（因为氨基酸被质子化）。无论在酸性还是碱性条件下，脂肽与BTB染料之间的相互作用主要是非共价性的（Zhu等人，2014年；Sheraz等人，2025年）。这些相互作用涉及脂肽表面活性剂中的正电荷氨基酸（如赖氨酸或精氨酸）与BTB染料中的负电荷磺酸基团（SO3?）之间的静电键（见图A.2）。
另一种用于筛选产生脂肽的微生物菌株的HTS方法是十六烷基吡啶氯化物-溴百里酚蓝（CPC-BTB）检测法。该方法使用CPC作为介质，CPC最初通过静电吸引力与BTB相互作用，使BTB从深蓝色变为黄绿色（图B.1）。加入脂肽后，脂肽竞争性地抑制BTB并与CPC反应，导致颜色从黄绿色变为深蓝色（Yang等人，2015年，见图B.2）。该方法对于识别阴离子型生物表面活性剂非常有用。Yang等人（2015年）使用污泥废水样本进行筛选，并测定了这些微生物产生的表面活性剂浓度，范围为100 μg/ml至600 μg/ml。后续通过HPLC、MALDI-TOF MS和MS/MS验证了表面活性剂的存在及其分子量和氨基酸序列。Zhou等人（2023年）使用CPC-BTB检测法快速检测了B. subtilis YPS-32产生的脂肽含量，并通过HPLC进行了确认，检测结果为0.926 g/l至1.4 g/l。
产生脂肽的微生物菌株也可通过基于荧光的十六烷基吡啶氯化物-荧光素（CPC-FL）检测法进行识别。这种染料作为指示剂，与CPC（作为介质/淬灭剂）混合后在pH 8条件下形成稳定的复合物，该复合物无荧光（图C.1）。加入脂肽提取物后，脂肽与CPC发生静电和疏水相互作用，竞争性抑制荧光素与CPC的结合，从而使荧光素释放，从而观察到荧光（Heuson等人，2018年，见图C.2）。该检测法通过淬灭剂-荧光团相互作用的动力学原理实现高特异性和灵敏度的脂肽识别。Heuson等人从法国Haut de France地区的农田土壤中分离出3株独特微生物菌株，并使用CPC-FL检测法快速测定其脂肽含量，结果为20 μg/ml至400 μg/ml。
除了上述高通量筛选方法外，还有一些其他检测方法，如PDA囊泡比色法和VPBO比色微孔板检测法，这些方法属于定性或半定性方法，无法准确测定微生物产生的脂肽浓度。Zhu等人（2014年）开发了PDA（聚二乙炔）囊泡比色法，其中PDA囊泡在脂肽与其相互作用时颜色从蓝色变为红色。然而，这种方法并非脂肽特异，因为糖脂、磷脂、脂蛋白、聚合物、麦角酸和脂多糖也会引起颜色变化。Kubicki等人（2020年）使用VPBO（Victoria Pure Blue BO）比色法筛选并定量了培养上清液中的非离子型糖脂MEL和脂肽serrawettin W1及N-酰基酪氨酸。该检测方法也不专门针对脂肽，可用于检测多种生物表面活性剂。
一旦高通量筛选实验确定了潜在的脂肽产生菌株，进一步评估其生物表面活性剂特性至关重要。通过油置换试验等筛选技术可评估生物表面活性剂在水面上的分散能力（即表面活性）。通过观察液滴在疏水表面的行为，滴落塌陷试验可评估表面张力的降低程度。乳化指数（E24）可反映生物表面活性剂的稳定性和工业应用性，该指数衡量其乳化碳氢化合物的能力（Walter等人，2000-2013年）。Anjum等人（2016年）使用油脂废物作为培养基，培养Bacillus sp. MTCC5877以生产生物表面活性剂，结果其ODA值为6.2 cm，EI24值为76%，表面张力从72 mN/m降低到30 mN/m。这些技术可验证产生脂肽的微生物菌株是否具有强效的生物表面活性。通过结合定性和定量测试，可精确选择有效的生物表面活性剂产生菌株。
本研究比较了三种现有的高通量筛选方法：溴百里酚蓝检测法、十六烷基吡啶氯化物-BTB检测法和CPC-荧光素检测法，并筛选出所有产生脂肽的微生物菌株。随后将这些菌株用于浸没发酵以生产生物表面活性剂，并通过油置换试验、滴落塌陷试验、乳化指数和表面张力等确认性检测方法评估其生物表面活性剂生成能力。
化学试剂和材料
溴百里酚蓝染料（Sigma Aldrich）、十六烷基吡啶氯化物（Sigma Aldrich）、荧光素（Sigma Aldrich）、LB培养基、24孔培养板、磷酸钠、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钾、硫酸钾、硫酸锰、硫酸铜。
样本收集
根据生理作用，产生生物表面活性剂的微生物分布于多种生境中。
微生物菌株的分离与定性高通量筛选
从收集的土壤样本中通过系列稀释分离出65株不同的微生物菌株。其中30株为重复菌株，在此步骤中被剔除。剩余的35株在Landy培养基上培养，并通过乳化指数和滴落塌陷试验检测其脂肽产生能力。乳化指数低于25%且滴落塌陷时间超过5分钟的菌株被丢弃。
讨论
为了节省时间和成本，需要开发一种灵敏度高、稳定且重复性好的方法来检测脂肽。目前研究人员使用BTB检测法、CPC-BTB检测法和CPC-FL检测法来筛选产生脂肽的微生物菌株，但尚未对其灵敏度和最低检测限进行评估。本研究对这些方法进行了分析和比较。
结论
本研究比较了BTB、CPC-FL和CPC-BTB检测法在脂肽定量方面的灵敏度和重复性。通过确定这些方法的最低检测限来评估其灵敏度，因为之前的研究均未进行此项检测。例如，Ong和Wu（2018年）检测到的最低脂肽浓度为150 μg/ml（0.15 g/l），而本研究检测到的最低浓度为0.506 μg/ml。
作者贡献声明
乌特普雷克莎·塔普利亚尔（Utpreksha Thapliyal）：负责撰写初稿、验证、方法设计和实验实施。桑吉塔·内吉（Sangeeta Negi）：负责审稿和编辑、项目管理和资源协调、数据分析及概念构思。
资金来源
本研究未获得任何资金支持。
未引用的参考文献
Dominika等人，2023年
Dybko和Wróblewski，1999年
Popkin等人，2017年
Shah等人，2025年
Valdés Velasco等人，2021年
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢印度阿拉哈巴德莫蒂拉尔·尼赫鲁国家理工学院生物技术系提供的实验设施和场地支持。
