双功能CRISPR/Cas12a辅助链置换反应结合RuHex负载的DNA凝聚体，用于超灵敏的电化学检测肝细胞癌mRNA

《Biosensors and Bioelectronics》：Dual-function CRISPR/Cas12a assisted strand displacement reaction with RuHex-loaded DNA condensates for ultrasensitive electrochemical detection of hepatocellular carcinoma mRNA

CRISPR/Cas12a辅助的链置换反应结合RuHex负载DNA凝聚体实现HCC相关mRNA超灵敏检测，通过双功能切割机制放大信号，检测下限达39.2 aM，并成功区分健康与早期HCC患者。

　　

刘洁彦|罗世华|陈思婷|陈冠峰|朱一平|娄玉欣|范瑞|张叶|潘洁珍|朱晨阳|徐丽云|李玲

广东医科大学医学技术学院，中国东莞523808

摘要

肝细胞癌（HCC）通常以临床沉默的方式发展，目前可用的诊断生物标志物的灵敏度和特异性不足，这仍然是其准确和早期检测的主要障碍。为了提高分子诊断性能，我们开发了一种双功能CRISPR/Cas12a辅助的链置换反应（dCas12a-SDR），该反应使用六胺钌(III)氯化物（RuHex）负载的DNA凝聚体，用于超灵敏和高特异性地检测与HCC相关的mRNA。在目标识别后，电极固定的捕获探针内先前隔离的Cas12a激活位点被暴露出来，从而诱导RuHex负载的DNA凝聚体（RuDC）中可访问的单链域与置换链（Ds）之间的杂交，最终导致电活性Ds-RuDC凝聚体的释放和Cas12a的有效激活。激活的Cas12a通过顺式切割去除激活位点，释放目标进入后续反应循环；同时，激活的系统开始切割电极上具有顺式切割基序的相邻捕获探针和Ds-RuDC组装体，从而促进RuDC从电极界面的释放。这种级联反应最终导致电化学信号的显著降低。由于这种由Cas12a介导的目标触发双顺式和逆式切割机制，该生物传感器实现了高效的信号放大。该平台对PD-L1 mRNA的检测限低至39.2 aM，并表现出优异的特异性、稳定性和重复性。此外，通过联合检测一组与HCC相关的mRNA（PD-L1、GPC3、EpCAM和FGA），该平台成功地区分了健康个体和早期肝细胞癌患者中的临床血清样本。总体而言，该平台为肝细胞癌的分子诊断提供了一个强大的工具。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，是癌症相关死亡的第三大原因（Chan等人，2025年；Koshy，2025年），在亚洲和非洲的疾病负担尤为沉重（Mak等人，2024年）。由于其隐匿的临床表现和明显的肿瘤异质性，大多数患者在中间或晚期才被诊断出来，错过了最佳治疗窗口，导致临床结果较差（McMahon等人，2023年；Song等人，2025年）。HCC的临床诊断主要依赖于医学成像（如超声、CT、MRI）（Afyouni等人，2024年；Chartampilas等人，2022年），结合循环蛋白生物标志物，尤其是α-胎蛋白（AFP）（Tayob等人，2023年；Yeo等人，2024年）。然而，基于成像的方法对小病变的敏感性有限，且高度依赖操作者（Chartampilas等人，2022年），而AFP的特异性不足，在部分患者中仍处于正常范围内（Hanif等人，2022年；Wang等人，2023年），导致漏诊，突显了需要更可靠的分子诊断工具的必要性。

HCC的特点是由于致癌激活和肿瘤微环境重塑而导致的严重转录失调（Hsieh等人，2026年）。异常的mRNA表达模式在肝细胞癌发生早期出现，反映了病理途径的激活和肿瘤的动态演变（Wurmbach等人，2007年）。在这种情况下，mRNA生物标志物作为肿瘤转录活动的直接分子指标受到了广泛关注（Beck等人，2021年；Hotz等人，2021年）。越来越多的证据表明，包括AFP mRNA和GPC3 mRNA在内的多种肿瘤相关mRNA被释放到循环系统中，在那里它们表现出高分子特异性和有希望的诊断潜力（Nguyen等人，2022年；Pan等人，2025年；Wang等人，2026年）。临床研究进一步支持循环肿瘤来源的mRNA作为血浆中的微创生物标志物，用于HCC的早期检测和预后分层（Block等人，2022年）。

与蛋白质生物标志物相比，mRNA在捕获动态转录改变和表型蛋白质积累之前的上游调控扰动方面具有明显优势，从而能够更早地分子检测恶性转化（Guo等人，2025年；Prabahar等人，2024年）。然而，循环mRNA的实际检测在技术上仍然具有挑战性，因为它们通常以极低的丰度存在，并且容易降解（Diaz和Bardelli，2014年）。已建立的分析方法，如RNA测序（RNA-seq）和定量逆转录PCR（qRT-PCR），需要繁琐的RNA分离工作流程和专用仪器，导致检测时间延长和操作成本较高（Kubista等人，2006年；Shi等人，2021年）。更重要的是，它们在复杂生物基质中的分析灵敏度和稳健性往往不足以可靠地检测低丰度转录本（Corchete等人，2020年；Wang等人，2009年）。因此，开发超灵敏、高特异性和临床适用的直接mRNA检测平台对于推进HCC分子诊断至关重要。

链置换反应（SDR）因其能够用一条DNA链置换另一条DNA链而广泛用于分子诊断中的信号放大，从而实现目标核酸的快速和灵敏检测（Simmel等人，2019年）。例如，SDR已被整合到基于DNA的传感平台中，提高了复杂生物基质中的分析灵敏度和稳健性能（Cencini等人，2025年；Jurinovi?等人，2025年；Simmel，2023年）。然而，这些方法存在固有的局限性，如在高背景噪声环境中灵敏度降低以及对复杂目标的特异性不足（Li等人，2025年；Wang等人，2018年）。最近的创新将CRISPR/Cas12a与SDR结合，进一步增强了其诊断能力。Cas12a是一种RNA引导的核酸酶（Liu等人，2025年；Xin等人，2025年），在目标识别时通过切割DNA来激活SDR，从而显著放大信号（Cheng等人，2023年）。虽然这种策略在提高检测灵敏度方面显示出潜力，但其有效性仍受限于需要高质量、丰富的目标分子，使其对于低丰度生物标志物的检测可靠性较低。

DNA凝聚体是通过静电相互作用、碱基对互补性或金属配位自组装形成的高密度、结构稳定的纳米结构（Muzzopappa等人，2021年），具有高秩序和可调的架构（Bucci等人，2024年；Yamashita等人，2024年）。与传统的单链或双链DNA探针（Adhikari等人，2022年；Everly等人，2025年；Ivanov等人，2023年；Zhang等人，2023年）相比，DNA凝聚体在信号分子装载能力、结构稳定性和抵抗生物基质干扰方面具有显著优势，使其在生物传感应用中特别有价值（Chen等人，2025年；Fabrini等人，2024年；Sabari等人，2020年）。研究人员利用DNA凝聚体作为信号放大单元构建了高灵敏度的电化学生物传感平台；例如，Ma等人开发了多价电化学标签，用于超灵敏检测肿瘤相关核酸（Ma等人，2024年），而Ning等人通过高密度封装电活性分子实现了低丰度生物标记物的稳定和可重复分析（Ning等人，2019年）。总体而言，由于其高度可编程的结构和出色的信号装载能力（Li等人，2023年；Luo等人，2023年），DNA凝聚体在高性能生物传感和精密诊断中具有重要的潜力。

在这项研究中，我们开发了一种双功能CRISPR/Cas12a辅助的链置换反应（dCas12a-SDR），使用六胺钌(III)氯化物（RuHex）负载的DNA凝聚体，用于高灵敏度检测与HCC相关的mRNA。该凝聚体是通过将四路DNA接头自组装成RuHex负载的DNA凝聚体（RuDC）构建的，实现了高效的RuHex封装，同时保留了可与置换链（Ds）杂交的可访问单链域，从而产生电活性Ds-RuDC凝聚体。通过一步退火过程，RuDC自组装成直径为10-40 μm的均匀球形凝聚体，表现出高结构稳定性和信号富集能力（图1A）。在电极表面上，硫醇化的捕获探针（CPs）通过与Ds-RuDC的杂交而固定。在目标mRNA存在的情况下，触发链置换反应，使Ds-RuDC从电极上释放，同时暴露crRNA识别位点并激活crRNA/Cas12a复合物。激活的Cas12a随后在电极结合的CP和自由的Ds-RuDC上进行顺式和逆式切割，导致差分脉冲伏安法（DPV）电流的降低。相反，在目标不存在的情况下，Cas12a保持不活跃，RuDC标记得以保留，产生更高的电化学信号（图1B）。这种双模式切割不断消耗链置换反应的中间产物，增强了反应驱动力，实现了mRNA的高灵敏检测。

基于这一设计，建立了一个针对四种mRNA生物标志物的多重检测面板，并应用于盲法临床血清样本。处理后的电化学信号产生了可区分的mRNA表达谱，能够准确区分健康个体和HCC患者（图1C）。总体而言，本研究提出了一种模块化、超灵敏和高特异性的电化学检测策略，将DNA凝聚体驱动的高密度信号富集与CRISPR/Cas12a介导的目标循环协同整合。dCas12a-SDR平台为肿瘤相关转录本的精确检测提供了强大的工具，并为HCC分子诊断的临床应用提供了新的机会。

RuDC的制备和表征

RuDC的成功制备对生物传感器的性能至关重要。我们首先对其形态和电化学性质进行了表征。使用明场显微镜和倒置共聚焦显微镜对RuDC的形成进行了形态学验证。如图1A所示，在明场显微镜下观察到大量分布均匀、大小一致、边界清晰的球形微/纳米结构，表现出典型的凝聚体特征。

结论

HCC继续对全球健康构成重大负担，主要是由于现有诊断生物标志物的灵敏度和特异性不足。作为非侵入性的分子指标，mRNA直接反映了肿瘤的转录活性，并表现出高肿瘤特异性。然而，由于它们在循环中的丰度极低以及与准确检测相关的技术挑战，其临床应用受到很大限制。

化学物质和试剂

本研究中使用的所有寡核苷酸（DNA和RNA）均由BGI Genomics（中国北京）定制合成。磷酸盐缓冲盐水（PBS）从Thermo Fisher Scientific购买。6×加载缓冲液和500 bp DNA标记物从Accurate Biology（中国湖南）购买。4S Green Plus、1× TE缓冲液和10× TBE缓冲液从Sangon Biotech（中国上海）获得。LbCas12a从New England BioLabs（NEB，中国广州）获得。TNaK缓冲液用20 mM制备。

CRediT作者贡献声明

潘洁珍：撰写——原始草稿，可视化，验证。范瑞：撰写——原始草稿，可视化，验证。张叶：撰写——审稿与编辑，监督，资源，方法学，形式分析，数据管理，概念化。刘洁彦：撰写——原始草稿，可视化，验证，概念化。罗世华：撰写——审稿与编辑，可视化，验证，概念化。朱晨阳：可视化，验证。李玲：撰写——审稿与

伦理声明

所有血浆样本均来自广州医科大学附属中医医院，符合机构伦理标准和《赫尔辛基宣言》（1964年）的原则。区域伦理委员会已批准伦理许可（2025NK057）。

出版同意

所有作者均已阅读并批准了最终手稿。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了以下资助：广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515012629）、湖南省自然科学基金（编号2025JJ60617）和常德市科技创新引导项目（编号2024ZD278）的支持。