《Biosensors and Bioelectronics》：Light-controlled RAA-Cas12a platform enables one-pot, ultrasensitive detection of
vibrio parahaemolyticus in seafood
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Vibrio parahaemolyticus检测中光控RAA-Cas12a一锅法实现超灵敏便携检测，通过2'-OH乙酰化锁定crRNA并UV可控激活，消除传统两步法交叉污染，灵敏度达1.36 copies/μL，性能接近qPCR。
林守佳|李金梅|卢博志|郎子月|邢高娃|万毅|贾彦伟|曹红梅
海南大学食品科学与工程学院，海口570228，中国
摘要
副溶血性弧菌（Vp）是一种重要的食源性病原体，对人类健康和海洋经济构成威胁，需要超灵敏的工具来实现其早期和准确的检测。在这项研究中，我们开发了一种光控的、集成的RAA（重组酶介导的等温核酸扩增）-Cas12a一锅法系统，能够实现Vp的超灵敏和高特异性检测。该光控系统利用乙酰化的crRNA，实现完全封闭的反应环境，光触发激活可以实现对反应过程的时间控制，并减轻RAA扩增与Cas12a切割之间的反馈导致的低灵敏度问题。与使用未乙酰化crRNA的传统方法相比，光控系统的灵敏度提高了两个数量级，达到了1.36拷贝/μL的检测限。我们进一步设计了一种便携式设备，结合所提出的传感策略，实现了与qPCR相当的检测性能，显示出在快速和高通量Vp检测方面的强大潜力。
引言
副溶血性弧菌（Vp）是一种常见的海洋细菌，存在于多种海产品中，如虾、鱼和贝类（Faulds等人2023年；Letchumanan等人2015年；Martinez-Urtaza和Baker-Austin 2020年）。它广泛分布于美国、日本和东南亚的沿海地区（Alipour等人2012年；Meghan等人2021年）。食用被Vp污染的生或处理不当的海产品可能导致急性胃肠炎、伤口感染甚至败血症（Chen等人2020年；Li等人2019年）。因此，开发一种快速检测Vp的方法对于解决食品安全问题和保护公众健康至关重要。传统的基于微生物培养的鉴定方法复杂且耗时，通常仅用于专门检测机构中的有限样本（Yoon等人2021年）。免疫测定方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）（Wang等人2023年）和侧向流动免疫测定（LFIA）（Park和Zhang 2024年），受到交叉反应的假阳性限制，并且难以区分毒力菌株和非毒力菌株或高度同源的菌株。分子生物学检测方法，如聚合酶链反应（PCR）和传统的等温扩增方法，可以通过识别核酸分子实现准确检测（Cao等人2019年；Geng等人2019年；Hu等人2022a年；Huang等人2020年；Lang等人2024年）。这些方法具有高灵敏度、操作简便且效率高，适合高通量快速筛查。然而，常用的分子生物学检测方法仍然面临气溶胶污染和引物特异性低等挑战。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）是一种基因编辑系统，涉及多种Cas效应器，包括Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas14a（Song等人2023年）。其中，Cas12a在诊断中特别有利，因为其结构简单且脱靶活性低。CRISPR RNA（crRNA）引导对核酸分子的识别和切割。Cas12a与crRNA结合后，能够特异性地识别目标DNA并在单链DNA（ssDNA）上激活强烈的非特异性切割活性（Cheng等人2025年；Lu等人2025年；Wang等人2025a年；Wang等人2025年）。由于其高特异性和切割效率，已经开发了多种CRISPR平台，如DETECTR（DNA内切酶靶向CRISPR转录报告系统）（Chen等人2018年）、POIROT（光启动的CRISPR–Cas12a系统用于强大的单锅检测）（Liu等人2024年）和HEPSD（高能量惩罚单核苷酸变异检测平台）（Liu等人2025年），用于诊断应用。通过将目标预扩增与CRISPR-Cas12a特异性信号输出分离，这种两步正交机制显著降低了非特异性扩增引起的假阳性风险。将Cas12a系统与PCR或等温扩增技术结合的传感器不仅结合了扩增方法的高灵敏度，还结合了Cas12a介导的识别和切割的高特异性。然而，Cas12a激活后对任何ssDNA的切割会破坏扩增系统的关键组分（引物和其他有效的ssDNA），降低扩增效率并导致灵敏度下降。因此，这些传感策略通常需要两步协议，先进行预扩增，然后进行Cas12a切割，以确保产生足够的Cas12a激活剂（Ding等人2020年；Huang等人2025年；Li等人2025年；Luo等人2025年；Zhang等人2020年）。然而，两步操作的复杂性和开盖及转移过程中的气溶胶污染风险阻碍了CRISPR-Cas12a的实际应用。实现一种兼容预扩增的一锅式Cas12a检测系统仍然是可编程CRISPR-Cas12a诊断发展的主要瓶颈。
光控技术是一种可编程和可调的化学控制策略，通过调节关键组分的化学活性来精确调控CRISPR系统的激活和失活（Hu等人2022年；Liu等人2025年）。基于此，一些团队通过使用光敏基团（如光可切割连接器（PC）或6-硝基哌酮氧甲基（NPOM）（Cho等人2024年；Hu等人2023年；Wang等人2024年；Jiang等人2025年）来开发了光控预扩增-CRISPR一锅法策略。这些策略在时间上分离了预扩增和Cas12a反应，成功实现了高灵敏度的一锅核酸检测。这种光控机制可以精确调节Cas12a切割的启动时机，使其与核酸扩增过程在时间维度上协调一致，有望解决传统集成方法中的反应不兼容问题，并为高效便捷的一锅核酸检测技术的发展提供新思路。然而，NPOM锁定crRNA的策略涉及将不同数量的基团连接到crRNA的特定碱基上，这需要根据不同的目标序列调整修饰的数量和位置，从而限制了其通用性和实际应用性（图S1）。此外，PC连接器调节通常通过额外的crRNA互补阻断链来实现，需要平衡抑制与不必要的自我激活或广泛的序列优化，进一步增加了序列依赖性（Hu等人2022年）。相比之下，我们的PLG策略直接锁定并恢复crRNA，无需引入额外的阻断链，从而提高了跨目标的通用性。
因此，本研究提出了一种通用的crRNA锁定策略。我们将锁定位置定在特征性的功能基团2′-羟基（2′-OH）上，该基团与crRNA序列无关。首先，合成了能够乙酰化羟基的光敏剂（PLGs）。然后，PLGs有效地锁定了crRNA链上的2′-OH，从而沉默了CRISPR-Cas12a系统。为了快速恢复Cas12a活性，将锁定的crRNA暴露在360纳米紫外光（UV）下几分钟，激活的Cas12a通过切割产生荧光信号。基于此策略，为了提高温度适应性，我们选择了在37°C下运行的重组酶介导的等温核酸扩增（RAA），并将其与Cas12a技术结合，构建了一种光控RAA-Cas12a一锅法（方案1）。此外，所提出的一锅法与自开发的便携式光控CRISPR检测设备相结合，实现了对实际样本中Vp的快速现场检测。通过光控，所提出的方法可以在时间维度上成功分离RAA和Cas12a检测，不仅消除了液体转移引起的气溶胶污染风险，还减弱了RAA和Cas12a反应之间的负反馈。其灵敏度比传统的RAA-Cas12a一步法高出两个数量级以上。此外，基于2'-OH乙酰化的crRNA锁定策略具有高度的通用性，无需复杂的修饰位点或数量筛选即可应用于不同目标。这一特性使其在多目标检测和需要快速诊断解决方案的资源有限环境中具有优越的潜力。
实验部分
一般实验
材料与试剂、PLGs的合成、crRNA的乙酰化锁定以及UV光控解锁的相关信息见支持资料。
光控CRISPR-Cas12a系统的分析
10 μL的光控CRISPR-Cas12a系统包括80 nM LbCas12a、120 nM部分或完全锁定的crRNA、两端标记有FAM和BHQ1的双标记报告探针（FQ报告探针）、1× Buffer 2.1、0.5 U/μL RNase抑制剂以及不同浓度的dsDNA目标。该系统使用UV灯（λ = 365 nm）进行照射
PLGs锁定和光控解锁crRNA
本工作的目的是控制crRNA的锁定和光解锁，以调节Cas12a反应系统的沉默和激活。在此工作中，crRNA在其2'-OH基团通过PLG进行位点特异性乙酰化（图1A，1B）。这种修饰对CRISPR-Cas12a系统具有双重抑制作用。首先，它破坏了crRNA的天然构象，影响其与Cas12a蛋白的稳定结合。其次，庞大的PLG部分产生了空间阻碍，防止了
结论
我们开发了一种通用的光控RAA-Cas12a一锅法，用于超灵敏和快速检测Vp。该系统使用PLG乙酰化的crRNA实现可逆的“锁定”和按需激活，通过精确的UV照射实现。这种策略最小化了非特异性背景，消除了两步反应中的开盖污染（Lu等人2022年；Yan等人2023年），并克服了预扩增和Cas12a切割之间的反馈导致的低灵敏度问题。
CRediT作者贡献声明
李金梅：验证、软件、研究、数据管理、概念化。卢博志：数据管理、概念化。万毅：写作——审稿与编辑、方法学。贾彦伟：资源、研究。郎子月：可视化、正式分析。邢高娃：资源、正式分析。曹红梅：写作——审稿与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取。林守佳：写作——初稿、正式分析、数据管理
未引用的参考文献
Hu等人，2025年；Hu等人，2022年；Wang等人，2025b年。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号22104027, 22364014）的支持。
