综述：原核生物Argonaute蛋白：从古老的防御机制到现代生物传感应用

《Biotechnology Advances》：Prokaryotic argonaute proteins: From ancient defense mechanisms to modern biosensing applications

原核Argonaute（pAgo）作为进化古老的核酸酶家族，具有温度适应性、PAM非依赖性等特性，在生物传感、基因编辑等领域展现应用潜力，但存在蛋白稳定性、信号放大等问题。

　　

陈 Wang|曾 Zhu|钱 Liu|杨立涛

上海交通大学海南研究院生命科学与生物技术学院代谢与发育科学联合国际研究实验室，上海200240，中华人民共和国

摘要

原核Argonaute（pAgo）蛋白是一个进化上非常古老的核酸酶家族，正在迅速发展成为一个多功能分子工具箱，可与CRISPR-Cas相媲美。本文综述了pAgo生物学和生物技术的最新进展，追踪了它们在嗜热、中温和耐寒菌株中的系统发育关系，并强调了与真核Agos不同的温度适应性催化特征。体内研究表明，pAgo在gDNA引导的宿主防御、转录沉默和重组中发挥作用，所有这些过程都是通过可编程的DNA或RNA引导的核酸酶活性来实现的。我们详细探讨了引导序列长度、5′核苷酸识别位点、二价阳离子和辅助因子如何调节切割效率，从而实现合理优化。随后，本文概述了基于pAgo的生物传感平台的快速发展，包括选择性核酸富集平台、超高灵敏度病原体检测方法、可编程DNA克隆系统和高分辨率成像技术。由于pAgo不依赖于原间隔区相邻序列（PAMs）、具有稳定的DNA引导序列、多轮周转动力学以及广泛的温度耐受性，使其成为CRISPR系统的理想补充。最后，我们指出了当前的研究局限性和未来发展方向，包括发现和工程化新的变体、阐明引导序列生成机制以及开发下一代基因编辑工具，旨在加速将这些多功能酶应用于实际生物技术和治疗领域。

引言

Argonaute（Ago）蛋白是最古老的核酸相互作用蛋白之一，在所有生命域中都存在（Olina等人，2018年；Swarts等人，2014b年；Tolia和Joshua-Tor，2007年）。虽然真核Agos（eAgos）主要通过RISC复合体介导RNA干扰（Sheu-Gruttadauria和MacRae，2017年），但原核Argonautes（pAgos）在底物识别和酶活性方面展现了显著的多样性，包括DNA引导的DNA切割（Kaya等人，2016年；Swarts等人，2015年；Wang等人，2008b年；Yuan等人，2005年；Zander等人，2017年）。这些蛋白存在于大约32%的古菌和9%的细菌基因组中（Koonin，2017年；Swarts等人，2014b年），作为先天免疫系统的组成部分，通过引导依赖的核酸酶活性抵御入侵的质粒和噬菌体（Olovnikov等人，2013年；Swarts等人，2014a年），生成小DNA片段作为后续靶向的二级引导序列（Swarts等人，2017年）。

与需要原间隔区相邻序列（PAM）识别的CRISPR-Cas系统不同，pAgos能够在没有目标限制的情况下立即进行核酸干扰。不同变体的温度适应性从超嗜热到中温都有，适应了多种生态环境（Swarts等人，2015年；Swarts等人，2014a年；Wang等人，2008a年；Cao等人，2019年；Kuzmenko等人，2019年；Liu等人，2021a年，Liu等人，2021b年）。这种特性，加上不依赖PAM的靶向能力，使得pAgos具有独特的应用前景：耐热型pAgos适用于高温分子生物学研究，而中温型pAgos则适用于生理诊断和编辑。因此，像NAVIGATER和PAND这样的平台为CRISPR生物传感器提供了替代方案（He等人，2019年；Song等人，2020年；Wang等人，2020年；Zhu等人，2022年，Zhu等人，2023年），尽管在体内应用中存在蛋白质稳定性、信号放大和错配容忍导致的脱靶效应等挑战。

本文系统地探讨了：（1）不同温度范围内pAgos的结构和酶学机制；（2）在防御和基因调控中的生理作用；（3）从这些古老酶衍生出的生物传感/基因编辑工具。通过整合进化、结构和生物工程方面的见解，我们阐明了从微生物防御到下一代诊断技术的转化过程，同时指出了如脱靶风险等局限性。

节选内容

ago蛋白的系统发育起源、进化多样性和结构架构

Ago蛋白家族的命名源于对拟南芥突变体的初步研究，其中突变植物叶片的卷曲特征类似于章鱼Argonauta argo的触手，因此该基因及其编码的蛋白质均以这种头足类动物命名（Bohmert等人，1998年）。尽管真核和原核变体之间的序列同源性较低，但ago蛋白在整体结构上表现出显著的保守性

pAgos的生化特性和全面分析

已研究的pAgos在热稳定性和底物特异性方面存在显著差异，这反映了它们对原生温度环境的适应（表1）。嗜热型变体通常需要较高的温度（>55°C）才能达到最佳活性，而中温和耐寒型同源蛋白在生理温度（4–40°C）下即可高效发挥作用，消除了体内应用的热障碍

pAgo系统的细胞功能和生物学作用

第3节阐述了核酸靶向的酶学基础：不同温度范围内的引导序列加载、底物特异性和切割机制（表1），本章探讨了这些生化活性在体内的部署和调控方式。除了上述针对入侵质粒和噬菌体的基础防御作用外，pAgos还参与复杂的细胞程序，包括转录调控、DNA复制协调和程序性细胞死亡（Koonin等人，

革命性的生物传感技术和诊断应用

pAgos所展示的引导依赖性结合和切割活性的高度特异性促进了多种技术平台上创新核酸传感器的开发，包括选择性核酸富集方法、超高灵敏度检测平台、可编程DNA克隆系统和高分辨率分子成像技术。在这些应用领域中，根据不同的温度依赖性特性，特定pAgo蛋白被重点介绍

当前挑战和未来研究方向

随着该领域从机制研究转向实际应用，明确pAgo系统与现有CRISPR-Cas技术之间的比较优势对于指导未来发展至关重要（Zhu和Yang，2024年）。虽然最初预计pAgo会成为Cas核酸酶的下一代替代品（Hegge等人，2018年；Swarts等人，2014b年），但后续研究揭示了它们各自独特的功能定位，而非简单的替代关系。

然而，关于pAgo的机制

未引用的参考文献

Garcia-Quintans等人，2020年

Li等人，2024年

Li等人，2024b年

Li等人，2025a年

Li等人，2025b年

Lin等人，2025a年

Liu等人，2023a年

Liu等人，2023b年

Lu等人，2024a年

Sun等人，2022a年

Sun等人，2022b年

Sun等人，2025a年

Sun等人，2025b年

Wang等人，2023a年

Wang等人，2023d年

Wang等人，2024b年

Wang等人，2024c年

Wang等人，2025a年

Wang等人，2025b年

Wang等人，2025c年

Zhao等人，2024a年

Zhao等人，2024b年

Zhao等人，2024c年

Zhao等人，2024d年

Zhao等人，2024e年

Zhu等人，2025b年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2023YFF1001600）、生物育种-国家重点科技项目（2022ZD04020）和Horizon Europe 2023项目“DETECTIVE”（101137025）的支持。