综述：用于表面展示的工程化导引/引导蛋白途径：结构限制、设计原则及生物技术潜力

本文系统分析了结构生物学最新进展对CU菌毛展示技术的影响，提炼了高密度多价展示的核心设计原则，并提出了面向合成生物学活菌疗法的工程策略，为构建可扩展的表面展示平台提供了理论框架。

　　

Jiaqi Liu|Siqi Lian|Congrui Zhu|Guoqiang Zhu

中国江苏省扬州市扬州大学兽医学院

摘要

伴侣蛋白/引导蛋白（CU）途径的菌毛是革兰氏阴性细菌中最多样化的菌毛类型。每根菌毛由数千个菌毛亚单位组成，数千根这样的菌毛可以同时展示在细菌表面，它们介导与环境适应相关的关键功能。由于其独特的结构特征，包括微米级的长度、高拷贝数和重复的亚单位组织，CU菌毛在生物技术和合成生物学中作为细菌表面展示平台具有内在潜力。20世纪80年代和90年代的早期研究探索了CU菌毛作为展示支架的潜力，但由于对菌毛组装机制的理解有限以及缺乏高分辨率的结构信息，未能开发出广泛适用或稳健的系统。近年来，随着CU菌毛及其组装中间体的原子和近原子分辨率结构的快速积累，以及蛋白质结构预测技术的进步，菌毛工程领域发生了根本性的变革。在这篇综述中，我们以大肠杆菌、沙门氏菌和鼠疫耶尔森菌中的结构明确的CU菌毛为参考模型，系统分析了控制基于CU菌毛展示的结构限制。我们通过统一的结构框架重新解释了之前的展示策略，提炼出定义工程可行性的保守设计原则，并提出了将CU菌毛扩展为多功能和可调表面展示平台的实际工程方法。总体而言，这项工作为评估合成生物学工具箱中CU菌毛展示系统的可行性提供了基于结构的指导框架。

引言

自20世纪80年代以来，肽和蛋白质展示技术逐渐成为探究大分子功能和筛选功能性配体的不可或缺的工具。其中，噬菌体展示是一项里程碑式的创新，它提供了一个可控的肽和蛋白质展示平台，推动了抗体发现和疫苗设计方面的重大突破。这项技术的变革性影响得到了2018年诺贝尔化学奖的正式认可（Smith, 1985）。

受噬菌体展示成功的启发，开发了多种替代展示系统，包括细菌展示（Stahl和Uhlen, 1997）、酵母展示（Boder和Wittrup, 1997）、真核病毒展示（Smith等人, 1983；Tatsis和Ertl, 2004）、哺乳动物细胞展示（Beerli等人, 2008；Ho等人, 2006）以及无细胞展示平台（Hanes和Pluckthun, 1997）。每种系统在文库规模、翻译后修饰能力和筛选效率方面都有独特的优势，共同构成了一个丰富且互补的现代展示技术生态系统。

细菌展示通常是通过将异源序列遗传融合到内源性细菌表面蛋白上来实现的，从而能够在细胞表面展示外源肽或蛋白质。多种表面结构被用作展示支架，包括细菌菌毛（Pallesen等人, 1995）、外膜蛋白（OMPs）（Georgiou等人, 1996）、V型分泌系统（也称为自转运蛋白ATs）（Maurer等人, 1997）和表面锚定蛋白（Samuelson等人, 1995）。其中，菌毛由于在革兰氏阴性细菌的定植、粘附和抵抗环境压力中的核心作用而受到了早期和持续的关注。

根据其组装机制，革兰氏阴性细菌中的菌毛可以大致分为四种类型：卷曲纤维、IV型菌毛、接合菌毛和伴侣蛋白/引导蛋白（CU）途径菌毛（Hospenthal等人, 2017）。其中，CU菌毛是最丰富和多样化的一类（Nuccio和B?umler, 2007）。它们卓越的结构稳定性、在细菌表面高密度多价展示的能力（Klemm和Schembri, 2000c），以及与宿主组织和环境界面的直接相互作用，使它们成为展示应用的特别有吸引力的支架。

早期的细菌展示研究主要集中在CU菌毛上，20世纪80年代和90年代的多个报告证明了将异源肽序列插入菌毛亚单位中的可行性（Bousquet等人, 1994；Hedegaard和Klemm, 1989；Thiry等人, 1989）。然而，由于对菌毛生物发生机制的了解有限，加上缺乏高分辨率的结构信息和合理的位点选择策略，CU菌毛展示未能发展成为一个通用且稳健的工程平台。

结构生物学的进步改变了这一领域。1999年，I型菌毛伴侣蛋白-亚单位复合体和伴侣蛋白-粘附素复合体的标志性X射线晶体结构揭示了伴侣蛋白辅助菌毛生物发生的分子基础，并确立了供体链互补（DSC）和供体链交换（DSE）的结构概念（Choudhury等人, 1999；Sauer等人, 1999），标志着基于结构的CU菌毛组装研究的开始。在获得菌毛纤维组装快照的冷冻电镜（cryo-EM）结构之前，捕获鼠疫耶尔森菌 F1抗原（Caf1）微纤维的晶体结构提供了供体链介导的亚单位连接的直接证据，并进一步表明保持的折叠能量驱动了纤维的形成（Zavialov等人, 2003）。2016年，首次报道了大肠杆菌 P菌毛纤维的近原子分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构（Hospenthal等人, 2016），为单体晶体结构和完整菌毛纤维的架构之间提供了概念和方法上的桥梁。这项工作为后续的菌毛纤维冷冻电镜分析建立了参考框架。

最近，高置信度蛋白质结构预测模型的出现，如AlphaFold（Abramson等人, 2024；Jumper等人, 2021）和RoseTTAFold（Baek等人, 2021；Bennett等人, 2025；Watson等人, 2023），极大地扩展了菌毛结构分析的范围。这些工具使得结构可视化和假设生成超出了少数几种研究透彻的“模型菌毛”（例如I型和P型菌毛），提供了系统探索整个CU菌毛家族结构多样性和工程潜力的前所未有的机会。

总体而言，这些技术进步为基于结构的CU菌毛展示系统的设计和重新工程提供了坚实的基础。在这篇综述中，我们综合了实验解析的CU菌毛结构，系统评估了控制展示可行性的结构限制，调查了现有的工程实践，并讨论了CU菌毛展示平台在合成生物学新兴应用（如活细菌治疗LBTs）中的潜力。

CU途径菌毛概述

基于菌毛引导蛋白（FUP）家族的系统发育分析，CU途径菌毛可以分为六个主要的进化支系，通常用希腊字母α、β、γ、σ、κ和π表示（Nuccio和B?umler, 2007）。CU组装系统以一个周质伴侣蛋白为中心，该蛋白协助菌毛亚单位的正确折叠，并与外膜引导蛋白合作，将这些亚单位组装并分泌到细菌表面。

控制CU菌毛展示的结构限制

CU菌毛作为展示平台的最直观优势在于其重复的主要亚单位的高拷贝数及其有序的表面排列。然而，菌毛的组装严重依赖于高度保守的折叠途径和亚单位间的相互作用。在本节中，我们从三个层次分析限制展示设计的结构限制：（1）CU菌毛亚单位的折叠和转运限制；（2）N端延伸（Nte）驱动的

基于CU菌毛的展示策略回顾：经验教训和设计建议

随着20世纪80年代至90年代噬菌体展示技术的出现，微生物学家开始探索在CU菌毛上展示异源肽的可行性。该领域的早期发展由Per Klemm及其同事在2000年进行了全面回顾（Klemm和Schembri, 2000c；a）。总体而言，先前的研究表明，基于CU菌毛的展示系统受五个关键参数的控制：（1）菌毛亚单位支架的选择；（2）融合位点的选择

用于活细菌治疗的基于CU菌毛的展示系统

基于CU菌毛的展示系统本质上建立在微米级细菌表达平台上。在合成生物学的框架内，一个特征明确、易于遗传操作的生物载体被称为底盘（de Lorenzo等人, 2021；Huang等人, 2024）。例如，大肠杆菌仍然是合成生物学中最广泛使用的底盘生物（Effendi和Ng, 2023）。从这个角度来看，CU菌毛

将CU菌毛定位为可通用的表面展示平台

Shaobo Yang及其同事最近对药物递送应用中的细菌表面展示技术进行了全面回顾（Yang等人, 2025）。在革兰氏阴性细菌中，已经成功利用外膜蛋白（OMPs）和自转运蛋白（AT）支架进行疫苗抗原展示、药物递送和受体靶向。这些平台的成功源于对支架蛋白折叠和转运的相对成熟的理解

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资助

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利益冲突声明

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