《PLOS Biology》：Cis-regulatory evolution of Wnt family genes contributes to a morphological difference between silkworm species
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本研究发现，家蚕与野桑蚕幼虫尾角大小的显著差异，主要由染色体4上一个保守Wnt家族基因簇（包含Wnt1、Wnt6等基因）的顺式调控元件（cis-regulatory element）进化所驱动。通过QTL定位、等位基因特异性表达（ASE）分析和CRISPR/Cas9基因敲除功能验证，研究揭示了Wnt1和Wnt6在尾角组织中的特异性表达下调是导致家蚕尾角缩短的关键遗传基础，阐明了上游发育调控基因通过组织特异性表达变化促成形态进化而不产生广泛有害多效性的模块化机制。
引言
理解形态进化的遗传机制是进化生物学的核心目标之一。在鳞翅目昆虫的幼虫中，存在着多种多样的附属物，其中天蚕蛾总科幼虫尾部一个被称为“尾角”的肉质突起，在不同物种间展现出显著的大小、形状和颜色差异。尽管其功能尚不完全明确，推测可能与伪装、感觉或防御有关。本研究利用家蚕与其近亲野桑蚕可产生可育杂交后代的特点，探究了二者间尾角长度差异的遗传基础。家蚕被认为在约4-10千年前从野桑蚕样的祖先驯化而来，两者在形态、生理和行为等多方面已产生分化。本研究通过种间杂交、高通量基因分型、基因表达分析和靶向基因敲除等手段，揭示了造成物种间尾角形态差异的遗传机制。
多个数量性状位点共同导致尾角长度的分化
家蚕幼虫第八体节上的尾角结构显著小于其野生姐妹种野桑蚕。定量测量显示，野桑蚕Sakado品系的尾角长度是家蚕p50T品系的3倍以上。两者的F1代杂交种的尾角长度处于中间值，表明野桑蚕中导致较长尾角的等位基因具有部分显性。通过构建回交一代和F2代两个杂交定位群体并进行QTL分析，研究在回交一代群体中鉴定出8个对尾角长度有显著影响的QTL。其中效应最大的QTL定位于染色体4上一个600 kb的区间，该位点解释了回交一代子代中18%的表型变异，以及物种间平均长度差异的11%。效应最大的三个QTL共同贡献了物种间27%的尾角长度平均差异。有趣的是，所有8个QTL的效应方向一致，即野桑蚕等位基因与更长的平均尾角长度相关，这表明尾角大小的差异不太可能仅由遗传漂变造成。在F2群体中，仅检测到染色体4上的一个显著QTL，这可能与较小的定位群体规模有关，但非QTL染色体上的野桑蚕血统比例仍能显著预测尾角长度，暗示存在许多小效应位点的额外贡献。
Wnt1和Wnt6在尾角组织中表现出特异性的顺式调控进化
位于染色体4QTL 1.5 LOD支持区间内的基因注释揭示了一个包含四个Wnt家族基因的基因簇。Wnt家族是分泌性生长因子蛋白，在动物形态发育中具有多种作用。通过分析早期幼虫阶段的组织特异性基因表达，研究发现只有Wnt6在野桑蚕的第八腹节中相对于家蚕表现出显著上调。为了在共同的顺式环境下比较等位基因表达，研究在F1代杂交幼虫的第五龄期，将第八腹节进一步解剖为尾角组织本身和剩余的“非角”组织，进行等位基因特异性表达分析。结果发现，只有Wnt1和Wnt6在尾角组织中表现出特异性的ASE，即家蚕等位基因相对于野桑蚕等位基因表达下调。同样的趋势在尾角差异较小的第一龄期幼虫中也存在。基因组DNA对照实验排除了扩增偏倚。重要的是，家蚕和野桑蚕的Wnt1和Wnt6蛋白氨基酸序列完全相同，表明任何功能差异都 solely 源于基因表达的顺式调控差异。通过RT-qPCR对表皮组织的时间进程表达分析进一步显示，Wnt1和Wnt6在尾角所在的A8体节表达更高，在野桑蚕中的表达水平持续高于家蚕，且这种差异在向第五龄蜕皮前达到峰值。物种水平的表达差异与F1代杂交种中的等位基因偏好高度一致，表明顺式调控分歧足以解释大部分观察到的物种水平表达差异，几乎没有证据表明存在重要的反式调控贡献。
功能分析揭示Wnt1和Wnt6对尾角长度进化的贡献
为验证Wnt1和Wnt6在尾角发育中的因果作用，研究使用了针对野桑蚕等位基因的CRISPR/Cas9介导的等位基因特异性敲除。在半同源品系T04中敲除野桑蚕来源的Wnt1等位基因，导致杂交幼虫的尾角长度减少51%。敲除野桑蚕来源的Wnt6等位基因也导致尾角长度减少，但效应较小，为7%。除了尾角长度外，在Wnt1和Wnt6敲除幼虫中未观察到任何色素沉着或形态变化。如果家蚕代表衍生状态，这些结果表明家蚕中Wnt1的表达下调在很大程度上导致了其相对于野桑蚕的尾角缩短。
讨论
Wnt1和Wnt6在物种间形态分化中的作用
本研究结果强调了物种间的形态分化如何由影响主要上游发育基因的组织特异性调控变化所导致。具体而言，顺式调控导致的家蚕发育中尾角内两个Wnt家族基因Wnt1和Wnt6的下调，是该物种尾角长度减少的最大单一贡献因素。Wnt家族基因在肢体和附属物发育中作用众所周知，但Wnt基因本身的进化变化驱动形态进化的明确例子很少。本研究首次将Wnt家族基因的顺式调控进化与形态结构的分化直接联系起来。Wnt1和Wnt6在基因组中物理相邻，具有重叠的表达域，且在家蚕尾角中共同下调，提示因果顺式调控变化可能涉及一个共享的角特异性增强子。等位基因特异性敲除进一步揭示两者对角的发育都有贡献，尽管程度不同，支持了部分功能冗余的观点。Wnt1在敲除实验中表现出更大的效应，表明其在此背景下功能更强或对剂量更敏感。这些发现表明，主要上游发育基因的顺式调控变化可以驱动近缘种和驯化动物间的形态差异，并说明了调控模块化如何解决与形态性状分化相关的发育权衡问题。
大效应位点对家蚕尾角进化的贡献
驯化为研究在强大且通常是定向选择压力下的快速进化变化提供了一个强有力的框架。本研究的QTL定位分析表明，除了Wnt1/Wnt6位点外，至少还有七个效应更小的位点对尾角长度变异有贡献。三个最大的QTL共同解释了物种间27%的平均尾角差异，表明多个中等至大效应位点解释了表型的很大一部分。此外，研究还发现位于已定位QTL之外的基因组背景存在可观的遗传贡献，这引出了尾角性状差异真实多基因性的问题。八个检测到的QTL中有七个估计效应值较小，可能反映了其真实效应值甚至更小，接近该定位群体的检测阈值。这意味着贡献位点的真实数量可能要多得多。虽然很少有研究详细量化基因组背景的相对贡献，但小效应位点对物种间形态差异的实质性贡献，可能是一个常见但常被忽视的特征。
塑造尾角进化的进化力量
驱动家蚕尾角缩短的选择压力仍不确定。驯化过程中对尾角长度的直接选择不太可能。然而，所有八个QTL效应方向的一致性，即野桑蚕等位基因均增加尾角长度，这反驳了纯粹的中性模型。一种可能性是尾角缩短是对其他性状选择的连锁反应。或者，尾角在驯化环境中可能变得不适应。野生天蚕蛾物种中角状结构的反复获得和丧失表明，自然选择曾反复作用于这一性状，可能针对相似的发育通路。Wnt家族基因表达的变化此前已被认为与近缘种间的形态差异有关。在鳞翅目中，Wnt1表达与色素沉着变异以及突起结构的形成有关。本研究结果扩展了这些发现，表明发育中尾角内Wnt1的组织特异性下调与Wnt1本身的顺式调控进化有关，而非反式作用因子的变化。关键的下一步将是确定导致家蚕中Wnt1/Wnt6下调的精确顺式调控元件。类似的调控模块很可能在鳞翅目昆虫的形态创新中被反复利用。
结论
本研究整合了数量遗传学和功能分析，揭示了区分近缘种的显著形态性状差异的分子基础。研究证明了关键发育基因Wnt1和Wnt6在空间上精确的调控变化是家蚕尾角缩短的基础。这些结果突出了顺式调控进化如何驱动形态分化，同时最大限度地减少多效性影响，强调了增强子模块化在实现适应性进化中的作用。这一原理很可能在进化发育生物学的各个系统和类群中具有广泛的适用性。
