《Current Opinion in Biotechnology》：Engineering the yeast
Yarrowia lipolytica for biomanufacturing
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本文综述了毕赤酵母在基因组编辑、系统生物学和工业生物制造中的应用进展，重点讨论了其生产神经酸、3-羟基丙酸、赤藓糖醇等高附加值产品，并分析了可持续生物制造的潜力及挑战。
魏江 | 宋京李 | 哈尔·S·阿尔珀 | 伊琳娜·博罗迪娜
诺和诺德基金会生物可持续性中心，丹麦技术大学，DK-2800 Kgs. Lyngby，丹麦
由于具有强健的生理特性和多样的代谢能力，产油酵母Yarrowia lipolytica已成为工业生物技术领域的重要细胞工厂。基因工具箱已从早期的非同源末端连接方法发展到精确的CRISPR编辑技术，最近又进一步发展为高通量基因组工程。基因组规模的代谢建模、“组学数据”以及其他系统代谢工程方法进一步加速了Y. lipolytica菌株在生物制造中的应用发展。本文综述了Y. lipolytica代谢工程的最新进展，涵盖了基因组编辑策略、系统级方法以及具有商业潜力的代表性工业和生物技术应用。这些进展共同使Y. lipolytica成为生物制造领域的主要微生物工具。
引言
Yarrowia lipolytica是一种产油酵母，常见于富含脂质的环境中[1]。它已成为生产脂质衍生物、有机酸和其他乙酰辅酶A（acetyl-CoA）衍生产品的理想菌株。多种Y. lipolytica菌株已获得“普遍认为安全”（GRAS）认证，可用于食品成分、添加剂和化妆品中，其中一些菌株已实现商业化生产。
与发酵酵母Saccharomyces cerevisiae不同，Y. lipolytica主要采用呼吸代谢方式，且不存在Crabtree效应，这使其在工艺优化和工业放大过程中具有更高的碳利用效率和更大的灵活性[2]。其独特的代谢和生理特性，包括丰富的乙酰辅酶A供应、较高的三羧酸循环（TCA cycle）通量[3]、代谢二态性[4]以及出色的疏水性底物代谢能力[5]，进一步凸显了其与传统酵母的区别。值得注意的是，Y. lipolytica能够利用多种低成本和废弃物底物，如橄榄油残渣[6]、食用油[7]和甘油[8]，从而增强了其在可持续生物加工中的吸引力。随着基因工程工具箱的不断扩展，Y. lipolytica在工业生物技术中的应用日益增多[9]。本文重点介绍了工具开发与商业应用之间的协同作用，特别关注那些已超越实验室规模的应用案例。同时，还讨论了代表性的高通量（HTP）和系统级方法，以及更广泛工业应用的挑战和未来前景。
基因组编辑策略的进展
Y. lipolytica的基因组编辑策略
对Y. lipolytica的研究从20世纪50年代对其生物量和代谢产物的初步观察，发展到如今借助基因组测序和基因工具实现的更高级应用（图1）。编辑技术从基于非同源末端连接的随机DNA整合，进步为精确的CRISPR靶向编辑[10, 11]。与此同时，合成生物学领域也开发出了多种生物部件，包括天然启动子、杂交启动子和可诱导启动子[12, 13, 14]等。
整合基因组模型（GEMs）和系统级方法进行合理菌株设计
基因组规模的代谢模型（GEMs）和系统级方法极大地扩展了菌株工程的设计空间，提高了“构建-测试-学习”循环的效率[25]。GEMs能够预测代谢通量分布，并为合理的设计策略提供“计算机模拟”指导。
商业和工业应用
先进基因工具的发展与Y. lipolytica作为工业宿主的地位密切相关。该酵母在多种条件下（包括广泛的pH值和盐度范围）都能保持稳定的表型[3]。重要的是，尚未发现对消费者有害的毒性代谢产物。其产生的产品如柠檬酸[30]和β-胡萝卜素[31]已获得GRAS认证并实现商业化生产（图2）。考虑到可持续性因素，人们对Y. lipolytica的兴趣进一步增加，因为它能够有效利用各种资源。
特种脂质/极长链脂肪酸（VLCFA）——神经酸
神经酸是一种存在于大脑和神经组织中的脂肪酸，其缺乏与多发性硬化症和阿尔茨海默病等神经系统疾病相关。研究表明，补充神经酸对小鼠模型具有有益效果[38]。植物种子来源的成本较高且产量不稳定，因此人们开始关注异源微生物的生产方式。
Y. lipolytica因其能够高效生产脂肪酸而被选为神经酸的生产宿主。
平台化学品——3-羟基丙酸（3-HP）
3-羟基丙酸（3-HP）是一种广泛应用于丙烯酸酯、聚酯等塑料生产中的大宗平台化学品。此前，多个学术研究实验室以及OPX Biotechnologies、Cargill和Novozymes等公司曾使用S. cerevisiae、Klebsiella pneumoniae、Corynebacterium glutamicum、E. coli等细胞工厂探索过3-HP的微生物生产。最近，Y. lipolytica也被作为3-HP的生产宿主进行研究，因为它具有较高的耐受性。
糖醇——赤藓糖醇
赤藓糖醇因其低热量特性而成为常见的食品甜味剂。由于Y. lipolytica在发酵过程中的稳定性以及可用的基因工程工具，它成为生产赤藓糖醇的理想宿主[3, 40]。通过CRISPR/Cas系统改造，研究人员培育出一种高产赤藓糖醇的菌株，在5升生物反应器中实现了256克/升的产量，葡萄糖转化率为0.58克/克，生产速率为1.73克/升/小时（通过靶向11个关键基因实现）。
食品产品——天然色素
Y. lipolytica作为食品生产平台受到越来越多的关注，尤其是在天然色素生产方面取得了显著进展。β-胡萝卜素等类胡萝卜素可作为天然色素和维生素A前体。通过强化甲瓦龙酸途径、提高乙酰辅酶A和NADPH的可用性，并通过多拷贝基因整合和启动子优化，研究人员成功提高了赤藓糖醇的产量，达到了39.5克/升的水平，这是酵母中的最高记录[43]。
药物——β-elemene
Y. lipolytica被研究用于生产多种药物化合物，其中β-elemene是一项重要的近期成果。β-elemene是从传统中药Curcuma wenyujin中提取的一种具有生理活性的倍半萜类化合物，具有广泛的抗肿瘤和抗炎作用。通过一系列合理的工程策略（包括增强前体供应、组合路径优化和减少竞争代谢途径等），实现了β-elemene的高效生产。
展望与未来趋势
过去十年中，
Y. lipolytica在学术和工业研究领域取得了显著进展。其丰富的代谢特性（如高乙酰辅酶A供应和高效的TCA循环）为多种天然产物的生产提供了支持。目前，遗传学、组学和计算资源的发展为
Y. lipolytica作为多功能模型和工业酵母的快速应用奠定了基础（图3，表S2）。
尽管取得了显著进展，但仍存在一些关键挑战。
CRediT作者贡献声明
魏江：概念构思、研究、初稿撰写、审稿与编辑、可视化设计。
宋京李：概念构思、研究、初稿撰写、审稿与编辑、可视化设计。
哈尔·S·阿尔珀：概念构思、撰写、审稿与编辑、资金筹集、项目监督。
伊琳娜·博罗迪娜：概念构思、撰写、审稿与编辑、资金筹集、项目监督。
致谢
本项目得到了以下机构的资助：诺和诺德基金会（丹麦）（授权协议编号：NNF20CC0035580、NNF20OC0060809、NNF21OC0072559）、欧洲研究委员会（欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助，比利时项目编号：101123257），以及美国国家科学基金会（CBET-2133660、CBET-1911469）。
