通过协同二次发酵消除高海拔大麦饮料中由枯草芽孢杆菌初次发酵产生的不良风味：工艺优化与机制解析

《Food Bioscience》：Addressing off-flavor from Bacillus subtilis primary fermentation in highland barley beverage through synergistic secondary fermentation: Process optimization and mechanism elucidation

高原青稞（Qingke） primary fermentation with B. subtilis KC-4 produces off-flavor compounds, but sequential secondary fermentation using L. plantarum, sweet wine koji, and W. anomalus significantly improves sensory quality (from 41 to 86) with optimized parameters (12°Brix, pH 5.0, 28°C, 5 days). GC-O-MS reveals metabolic redirection to ester synthesis (OAV≈1500 for isoamyl acetate).

　　

何世辉|芮月月|刘慧翠|夏文辉|王树林

青海省农业大学农业与畜牧业学院，西宁810016，中国

摘要

为了解决使用枯草芽孢杆菌KC-4（Bacillus subtilis KC-4）进行高原大麦初级发酵时产生的不良风味问题，本研究旨在通过协同的二次发酵开发出一种风味宜人、酒精含量低的饮料。通过多阶段筛选，选取了由Wickerhamomyces anomalus（W. anomalus）、甜酒曲（一种粉末状发酵剂）和Lactiplantibacillus plantarum（L. plantarum）组成的最佳微生物组合，并采用了顺序接种策略：首先接种Lactiplantibacillus plantarum（L. plantarum），然后同时接种甜酒曲和Wickerhamomyces anomalus（W. anomalus）。通过单因素实验和响应面分析法（RSM）优化了关键发酵参数，具体如下：初始糖含量为12°Brix，初始pH值为5.0，Wickerhamomyces anomalus（W. anomalus）的接种量为7%，接种比例为1:1:2（L. plantarum : 甜酒曲 : Wickerhamomyces anomalus），发酵温度为28°C，发酵时间为5天。在这些条件下，饮料的感官评分从41（初级发酵产物F1）显著提高到86（二次发酵产物F2），酒精含量为8.9%（体积百分比）。顶空固相微萃取结合气相色谱-嗅闻-质谱（HS-SPME-GC-O-MS）分析表明，F1中的不良风味主要来源于乙醇、3-羟基-2-丁酮和短链脂肪酸。相比之下，F2中的酯类物质显著增加，如异戊基醋酸酯（气味活性值OAV ≈ 1500）和乙基醋酸酯（OAV ≈ 77），表明代谢途径从不良风味积累转向了酯类合成。这些发现表明，协同的二次发酵有效改变了风味代谢，显著提升了饮料的感官品质，并为开发高质量谷物基发酵饮料提供了风味调控的机制见解。

引言

高原大麦（Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook.），在中文中被称为“青稞”，是中国青藏高原的主要谷物作物（Xie et al., 2024; Yang et al., 2024）。它富含多种营养成分和生物活性化合物，是β-葡聚糖、膳食纤维、γ-氨基丁酸（GABA）和多酚的优质来源（Wu et al., 2025; Dang et al., 2022）。这些健康益处，如抗氧化作用（Qin et al., 2023）、降胆固醇作用（Zhou et al., 2022）、调节血糖作用（Zang et al., 2023）以及调节肠道微生物群的作用（Li et al., 2022），激发了人们对利用高原大麦制作功能性食品的兴趣。

然而，高原大麦本身存在一些局限性，如风味不足、质地粗糙、加工性能差和感官品质不佳，这些因素共同导致了最终产品市场接受度较低（Liu et al., 2022）。在这种情况下，微生物发酵技术作为一种有效策略，可以通过降解大分子、生成生物活性化合物和合成挥发性芳香物质来从根本上改善谷物的质地、营养价值和风味特征（Li et al., 2025; Zhang et al., 2025; Tamene et al., 2022）。因此，生产高原大麦酒精饮料可能是提升该作物价值的关键途径（Chen et al., 2024）。已有研究报道了发酵技术在高原大麦食品生产中的应用（Wang et al., 2022; Yang et al., 2025）。

在各种发酵工艺中，液态发酵相较于固态发酵具有明显优势，例如能够有效分离菌丝体与发酵产物，并同时回收和优化菌丝体和发酵产物中的功能性成分（Gao et al., 2025; He et al., 2024）。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）因其高淀粉酶和蛋白酶活性而常被用作液态发酵的发酵剂。它可以高效降解高原大麦中的大分子，从而产生丰富的糖分和后续微生物代谢所需的前体物质（Ruan et al., 2020）。然而，单一菌种发酵往往会导致不良风味化合物（如短链脂肪酸）的积累，从而影响产品的感官品质（Cao et al., 2024）。因此，关键挑战在于在发挥其高效酶解能力的同时，精确调控风味代谢途径。

协同发酵技术通过引入功能互补的微生物，为系统地调节发酵风味提供了有效策略（Canonico et al., 2018; Sharma et al., 2021）。这种方法不仅可以通过微生物协同作用掩盖不良气味，还能主动引导愉悦芳香化合物（如酯类）的合成（Marangon et al., 2023; Li et al., 2022）。目前关于高原大麦饮料的研究主要集中在单菌种发酵或涉及同时接种的协同发酵技术上（Chen et al., 2023; Chen et al., 2024）。然而，单菌种发酵常常伴随着不良风味化合物的积累；虽然同时接种旨在实现风味互补，但由于微生物之间的早期竞争，可能会抑制某些菌种的代谢活性，从而影响风味调节的效果（Mu?oz et al., 2014）。相比之下，顺序协同发酵通过分步接种实现了不同微生物之间代谢任务的解耦：首先使用具有高酶活性的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）进行底物水解和基质修饰；随后引入具有风味功能的微生物，在这种优化的微环境中高效合成目标芳香化合物。这一过程本质上是一种基于微生物生态学的风味调节机制，而不仅仅是简单的技术叠加。尽管这种策略在定向减轻枯草芽孢杆菌初级发酵液中的不良风味方面具有潜力，但其在大麦发酵中的应用尚未得到系统研究，相关的代谢重定向机制和风味演变规律仍大部分未知。

本研究旨在建立一个高效的协同二次发酵系统，以改善枯草芽孢杆菌KC-4对高原大麦水提取物进行初级发酵时产生的不良风味问题。首先通过多阶段筛选确定最佳微生物组合和接种顺序，随后优化关键参数。接着利用HS-SPME-GC-O-MS和OAV分析来分析关键芳香活性化合物的演变情况。总体而言，这项工作阐明了协同发酵系统如何将不良风味转化为愉悦风味，从而建立了一个优化的工艺流程，并为风味调控提供了基本的机制见解。

材料与试剂

高原大麦颗粒（品种“昆仑14”）由青海省农林科学院提供（西宁，中国）。用于初级发酵的淀粉水解菌株枯草芽孢杆菌KC-4由我们的实验室从高原大麦酒发酵剂中分离得到，并根据形态特征和16S rRNA基因序列分析进行了鉴定（GenBank登录号：PX411802）。Lactiplantibacillus plantarum（Lp90）购自西安。

最佳微生物组合和接种顺序的确定

为了构建一个高效的二次发酵系统，系统评估了八种候选菌株在单菌种、双菌种和三菌种发酵中的表现。结果显示（图1），三菌种协同共培养C18（W. anomalus、甜酒曲和Lactiplantibacillus plantarum）的效果最佳，其感官评分显著高于单菌种（Fruit wine yeast A5）或双菌种组合（B5；W. anomalus + 甜酒曲）。

结论

本研究表明，顺序协同二次发酵是改善高原大麦饮料风味特性的有效策略。在优化条件下（12°Brix，pH 5.0，28°C，5天），先接种Lactiplantibacillus plantarum，再同时接种Wickerhamomyces anomalus和甜酒曲，成功将风味不佳的初级发酵产物（F1）转化为高质量产品（F2）。感官评分从41显著提高到86。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

作者贡献声明

王树林：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源管理，项目协调，资金获取，数据分析，概念构思。夏文辉：监督。何世辉：撰写 – 原稿撰写，数据可视化，方法学设计，实验实施，数据分析。刘慧翠：监督，资源管理，概念构思。芮月月：撰写 – 审稿与编辑，数据验证，软件应用，数据管理

未引用的参考文献

Boateng and Yang, 2021; Chen et al., 2022; Chen et al., 2024; Khatri and Chhetri, 2020; Li et al., 2025; Li et al., 2022; Maicas and Mateo, 2023; Zhou and Wu, 2022.

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了中国科技部“科技助推经济2020”（SQ2020YFF0420513）关键项目的支持。