《Food Bioscience》：High-level expression of
Pandalus borealis duplex-specific nuclease by
Komagataella phaffii via promoter and peptide selection
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本研究通过改造 Komagataella phaffii 的强效诱导型启动子 mPAOX1，结合 α-因子和 Ost1-α 融合信号肽优化，实现了 Pandalus borealis DSN 的高效表达。经发酵条件优化后，发酵液 DSN 活性达 2.6×105 U/μL，并通过纯化获得冻干样品，其特性经表征验证，为工业级生产提供了新方案。
郑晓|王月|周华兰|王继国|丛文杰|张建国
上海科技大学健康科学与工程学院
中国上海中工路516号，200093
摘要
双链特异性核酸酶（DSN）是专门用于降解双链DNA（dsDNA）及DNA-RNA杂交双链的必需成分，在食品分析和生物样本处理中得到广泛应用。然而，利用基因工程生产DSN的案例较少，这限制了其应用范围并提高了成本。在本研究中，通过选择启动子和信号肽、优化表达盒以及培养条件，成功在微生物宿主Komagataella phaffii中表达了Pandalus borealis的DSN基因，发酵液中的DSN活性达到2.6×10^5 U/μL。随后采用简单纯化工艺制备了可用于表征的冻干DSN。该DSN的Km值为399.04 ng/μL，Vmax为1.7×10^6 μmol/(μL·min)，最佳作用温度为37°C，并且需要Mg^2+和Mn^2+激活。因此，该DSN的应用潜力得到了充分验证。
引言
双链特异性核酸酶（DSN）是一种重要的水解酶，来源于多种生物体，如Paralithodes camtschaticus（Shagin等人，2002年）和Pandalus borealis（Nilsen等人，2010年），能够特异性地降解双链DNA（dsDNA）及DNA-RNA杂交双链（Qiu等人，2015年）。尽管许多研究者声称DSN能够完美降解10–12个碱基对的双链结构（Wu等人，2020年），但目前尚未获得其晶体结构。根据Universal Protein Knowledgebase（UniProt，Consortium，2024年）中的结构模拟和序列比对（Nilsen等人，2010年），Pandalus borealis DSN的活性位点为His234，金属离子结合位点为Asn264。DSN还包含一个约20–30个氨基酸组成的信号肽以及一个非特异性的DNA/RNA内切酶结构域。该非特异性内切酶结构域含有三个Arg残基（Arg, Arg, Arg），这些残基位于或靠近活性位点（His），可能参与底物结合（Shlyapnikov等人，2000年）。
因此，DSN在许多领域被广泛用于RNA检测过程中的DNA纯化，包括食品科学（Zhulidov等人，2004年）、生物多样性鉴定（Wu等人，2025年）和体外诊断（Huang等人，2019年）。Zhulidov等人利用Paralithodes camtschaticus的DSN开发了一种跨物种的cDNA标准化方法，以避免因转录本丰富而产生的新cDNA干扰（Zhulidov等人，2004年）。Ashraf等人使用DSN将凝血酶的检测限降至0.039 pmol/L，显示出比其他技术更优异的检测灵敏度和更宽的线性范围（Ashraf等人，2022年）。DSN还能在dsDNA和DNA-RNA杂交双链中识别单个错配核苷酸，适用于miRNA分析（Wang等人，2015年）。随着CRISPR/Cas系统与DSN结合用于基因编辑和生物检测（Pragya等人，2025年；Yao等人，2024年），DSN的应用范围进一步扩展到生物传感器构建、合成基因电路（Gong等人，2021年）以及mRNA cDNA文库的制备（Yi等人，2011年）。因此，亟需大量生产DSN以满足市场需求。
然而，现有的DSN制备过程复杂，纯度低且成本较高。通过多种微生物宿主和表达策略实现重组DSN的高水平表达成为研究热点。Anisimova等人克隆了Paralithodes camtschaticus的DSN基因，并在大肠杆菌中异源表达，通过从包涵体中复性获得了活性DSN（Anisimova等人，2008年）。后来，虽然产率不高，但利用杆状病毒-昆虫细胞系统也成功表达了Pandalus borealis的DSN（Hirakawa & Ohiso，2009年）。因此，考虑到从天然来源制备DSN的复杂性及异源表达的难度，采用工业微生物宿主表达DSN显得十分必要。
Komagataella phaffii是一种具有出色重组蛋白表达能力的甲基营养酵母，其强大的乙醇氧化酶1启动子（PAOX1）、分泌表达模式以及高细胞密度发酵特性使其成为理想的选择（Ergün等人，2021年）。截至目前，已有超过5000种重组蛋白在K. phaffii中成功表达（Vijayakumar & Venkataraman，2024年）。提高重组蛋白表达水平的有效策略包括使用强启动子（Zhou等人，2025年）、多拷贝基因表达（Aw & Polizzi，2013年）以及适应性培养优化（Looser等人，2015年）。尽管近年来出现了新的启动子（Shen等人，2024年），但PAOX1仍是K. phaffii中最常用的启动子。
本研究采用了一种改良的PAOX1（mPAOX1），其中删除了D3片段，该启动子被证明具有极强的活性（Feng等人，2025年），并在本研究中重新命名为mPAOX1用于DSN表达。结合信号肽的选择，常用的重组蛋白分泌信号肽为Saccharomyces cerevisiae S288C的α因子（Dai等人，2024年），或新的有潜力信号肽（如S. cerevisiae JK9-3da的Ost1肽（Fitzgerald & Glick，2014年）。研究表明，信号肽的合理组合可显著提升重组蛋白分泌效率（Barrero等人，2018年）。因此，通过优化启动子和信号肽的组合、增加基因拷贝数及培养条件，实现了DSN的高水平表达。随后通过纯化工艺制备DSN并研究了其特性，为市场供应提供了有效方法。
菌株与载体
DSN表达所使用的微生物宿主和原始载体分别为K. phaffii GS115和Invitrogen公司的pPIC9K（隶属于Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。除特别说明外，所有试剂均购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（中国上海）。酵母提取物和蛋白胨购自Oxoid（Thermo Fisher Scientific旗下公司）。所有分子生物学试剂盒均购自Vazyme Biotech Co., Ltd.（中国南京），除非另有说明。
DSN表达的启动子和信号肽选择
图1A-D中的四个基因表达盒分别通过PAOX1、Ost1信号肽与α因子的融合体以及新的mPAOX1（去除17个核苷酸）驱动DSN的表达和分泌。经DSN基因扩增和测序验证后，获得了四种重组K. phaffii菌株：PAOX1-α、PAOX1-Ost1-α、mPAOX1-α、mP
结论
本研究报道了利用重组K. phaffii成功表达DSN的案例，此前仅有少数研究报道在E. coli中实现DSN表达。通过选择合适的启动子和信号肽、优化拷贝数及培养条件，重组DSN的表达水平达到2.6 ×10^5 U/μL，这是文献中首次报道的数值。随后对DSN样品进行纯化并冻干，以进一步研究其特性。
作者贡献声明
张建国：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、研究监督、资金申请、概念构思。周华兰：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计。王月：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学设计、实验实施。丛文杰：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、研究监督、数据分析。王继国：验证、实验实施。郑晓：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写。
伦理声明
作者声明无利益冲突。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
数据共享
本研究的数据可应合理请求向通讯作者索取。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务关系/个人关系：张建国表示本研究获得了国家重点研发计划的支持。若有其他作者参与，他们声明不存在可能影响本文研究的财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2025YFA0922200）和国家自然科学基金（编号32572515、W2512043）的支持。
