卵白蛋白/阿拉伯胶复合物稳定的W/O/W乳液的界面行为与稳定性：四阶导数荧光法

《Food Chemistry》：Interfacial behavior and stability of ovalbumin/gum arabic complex stabilized W/O/W emulsion: fourth derivative fluorescence method

OVA/GA复合物通过直接混合制备，作为W/O/W双乳液外相稳定剂，有效提升维生素B12包封率与胃酸稳定性。利用第四阶导数光谱和光散射分析发现，总浓度0.6%、OVA:GA=1:2时，pH从中性至酸性导致复合物结构变化（Df=1.2→3.1→2.7），pH 4.4-3.7时界面厚度和稳定性显著增强，包封率达85%以上。该研究为开发稳定生物活性物质递送载体提供新策略。

　　

Fuge Niu|Chunfang He|Huabin Liao|Feina Gu|Jianzhong Zhou|Yixuan Du|Weichun Pan

浙江省食品科学与生物技术学院，浙江省工商大学，食品安全重点实验室，杭州310018，中国

摘要

本研究通过直接混合制备了卵清蛋白（OVA）/阿拉伯胶（GA）复合物，并将其用作乳化剂来稳定W/O/W双乳液的外水相，从而构建了一种有效的维生素B₁₂（VB₁₂）输送系统。利用四阶导数光谱和光散射等技术分析了OVA/GA复合物在油水界面的吸附和稳定机制。结果表明，当OVA/GA总浓度为0.6%且OVA:GA质量比为1:2时，pH值从中性变为酸性时，复合物的分形维数（Df）从1.2增加到3.1，然后又降至2.7，表明pH值会影响复合物的结构。在pH值为4.4、4.0和3.7时，界面的厚度和稳定性显著提高。该乳液实现了超过85%的包封率，并表现出对胃环境的增强抵抗力，确保了VB₁₂的有效保护和控制释放。本研究为开发食品中生物活性物质的稳定输送载体奠定了基础。

引言

W/O/W双乳液是一种由水相、油相和两亲性乳化剂组成的多相胶体系统。其独特的三相结构能够实现亲水/疏水生物活性化合物的共载和稳定（Cui等人，2023年）。由于该乳液系统能够生产低热量食品、掩盖不良气味并提高敏感成分的稳定性，因此受到了研究人员越来越多的关注（Giroux等人，2013年；O' Dwyer等人，2013年）。然而，由于界面高的吉布斯自由能导致的热力学不稳定性仍会引起絮凝和分层（van Aken，2004年）。与传统乳液相比，W/O/W系统表现出更复杂的不稳定机制，包括内部水滴的成熟、由水滴迁移引起的油膜破裂以及由渗透压差异驱动的界面质量传递。因此，合理设计界面吸附层对于提高乳液稳定性至关重要（Jafari等人，2008年）。

提高乳液稳定性的策略包括添加电解质（Kwak等人，2022年）、将凝胶剂或增稠剂加入内水相（Zhu、Qiu等人，2018年）以及选择合适的乳化剂（Kralova & Sj?blom，2009年）。然而，这些方法存在明显局限性：电解质可能导致水滴变形或不稳定，而凝胶剂会增加配方复杂性和加工成本（Zhu、Feng等人，2018年）。在这种情况下，蛋白质作为一种有前景的天然乳化剂脱颖而出，因为它们具有生物降解性、可食用性和有效的界面活性（Wilde等人，2004年）。两亲性使蛋白质能够吸附在界面上，抑制水滴的絮凝和聚集（Lam & Nickerson，2013年；Téllez-Morales等人，2020年）。然而，蛋白质的乳化性能往往受到其分子构象和聚集状态的限制。像乳清蛋白分离物和OVA这样的天然大分子符合绿色生产原则，但在其等电点附近面临聚集和絮凝的挑战（Hongrui等人，2022年；Hu等人，2020年）。为了克服这些限制，最近的研究集中在开发基于蛋白质的复合乳化剂上，为实现长期稳定的乳液提供了有希望的策略（Cai等人，2023年；Santos等人，2022年）。

多糖由于其高度分支的结构，通常表现出有限的界面活性，但它们可以通过静电相互作用与蛋白质协同稳定界面（Albano等人，2019年）。阿拉伯胶（GA）是一种从金合欢树中提取的天然多糖，由于其优异的溶解性、低粘度和形成稳定界面层的能力，在食品工业中被广泛用作乳化剂和稳定剂（Khubber等人，2025年；Wang等人，2025年）。先前的研究表明，GA与OVA的结合可以通过静电相互作用形成可溶性复合物，从而增强乳液膜的界面吸附力和机械强度，进而提高W/O/W乳液的稳定性和控制释放性能（Yang、Yao等人，2023年）。这样的蛋白质-多糖复合物不仅增强了界面机械强度，还通过空间位阻效应提高了对pH值和离子强度变化的抵抗力（Li等人，2020年；Salminen & Weiss，2014年；Tavasoli等人，2022年）。尽管有这些优势，混合过程中可能形成异质颗粒是一个主要的实际挑战，这会导致界面覆盖不均匀，最终影响双乳液的稳定性。因此，精确控制pH值和组分比例等参数以优化复合结构对于提高界面吸附效率至关重要。基于此，我们假设在受控条件下通过直接混合制备的优化OVA/GA复合物将形成连续、强韧的界面层，显著提高W/O/W乳液的物理稳定性。本研究旨在通过研究不同pH条件下OVA/GA复合物稳定的W/O/W乳液的界面行为和稳定性来验证这一假设。

多年来，荧光光谱已被用于表征蛋白质的构象和分子间相互作用（Brown & Royer，1997年；Yan & Marriott，2003年）。其主要优点在于无需外源性探针和复杂的样品制备即可检测蛋白质结构和界面行为（Genot等人，1984年；Lakowicz，2006年）。特别是Trp荧光对微环境极性非常敏感，能够检测三级结构变化（例如构象变化、配体结合或变性）。值得注意的是，通过计算发射光谱的四阶导数，可以区分Trp残基在疏水环境和亲水环境中的分布（Granger等人，2005年）。然而，这项技术很少被用于阐明乳液中蛋白质-多糖复合物的界面吸附机制。

本研究使用OVA/GA复合物构建了W/O/W乳液系统，用于装载和输送VB₁₂。分析了OVA/GA复合物的结构及其在油水界面的吸附情况，以评估其对乳液稳定性和VB₁₂释放的影响。本研究的结果为开发稳定且高效的输送载体提供了新方法，并为促进生物活性物质在乳化食品系统中的应用提供了基础数据。

材料

卵清蛋白（OVA，冻干粉，44.2 kDa，≥90%）、阿拉伯胶（300 kDa，60–130 mPa·s）和维生素B₁₂（VB₁₂，98%）购自中国上海的中药化学试剂有限公司。聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR）购自中国上海的Macklin生化有限公司。葵花籽油购自杭州永辉超市。所有其他试剂均为分析级，也来自中国上海的Macklin生化有限公司。

OVA/GA复合物的制备

OVA/GA

分析不同pH下OVA和GA的聚集行为

通过分析浊度和光强度（图1A）研究了pH对OVA/GA复合物形成的影响。这两个参数都显示出随pH值降低而增加的趋势。当pH值从7.0降至5.0时，OVA/GA复合物的浊度保持在低吸光度值，而光强度略有增加。这种现象可以归因于OVA和GA的分子电荷特性。OVA的等电点（pI）为4.5–4.8

结论

总之，通过直接混合方法成功制备了由OVA/GA复合物稳定的W/O/W双乳液，从而开发了一种高效的VB₁₂输送系统。使用四阶导数光谱和光散射技术系统地研究了OVA/GA复合物的吸附行为和界面稳定机制。当OVA/GA总浓度为0.6%且OVA:GA质量比为1:2时，pH值从中性变为酸性时

CRediT作者贡献声明

Fuge Niu：项目管理、方法学、研究。Chunfang He：撰写——原始草稿、验证、软件、项目管理。Huabin Liao：验证、数据管理。Feina Gu：项目管理、资金获取、正式分析。Jianzhong Zhou：可视化、软件、正式分析。Yixuan Du：验证、监督。Weichun Pan：验证、资源管理、研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢浙江省自然科学基金（LMS26C200007、LY22C200009）和国家自然科学基金（31701650、31171713）、国家重点研发计划（2018YFD0400303）、研究生研究创新基金年度重点项目（YBXM2024056）、浙江省“新苗”（潜力）大学生计划（2025R408A004）的支持。