《International Dairy Journal》：Quantitative evaluation of food additive dyes on the aggregation of randomly coiled casein
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本研究探讨酸性条件下人工食品色素喹诺酮黄（QY）和偶氮红（AR）与酪蛋白的相互作用及聚集机制，通过UV吸收、荧光光谱及圆二色光谱分析，发现QY和AR通过静电和疏水作用诱导酪蛋白构象变化，形成β-折叠结构，影响其理化性质，提示食品添加剂可能对蛋白质功能产生负面影响。
Neha Kausar Ansari | Hamida Nasir | Aabgeena Naeem
印度北方邦阿里格尔202002，阿里格尔穆斯林大学生命科学学院生物化学系
摘要
人工食品添加剂——喹啉黄（QY）和阿鲁拉红（AR）在食品加工中广泛使用，以改善食品的颜色和外观。本研究展示了在pH 2条件下，随着QY和AR浓度的增加，牛奶蛋白（酪蛋白）之间的相互作用和聚集现象。通过紫外吸收光谱和荧光测量验证了酪蛋白-染料复合物的形成。这种相互作用通过静态淬灭机制和自发结合形成复合物，其中范德华力和氢键起到了关键作用。同步荧光分析表明色氨酸残基周围的微环境发生了变化。随着QY和AR浓度（0-400 μM）的增加，聚集程度也随之增加，这一点通过浊度测量和RLS荧光技术得到证实。随机卷曲的酪蛋白转变为交叉β结构，这一点通过CD光谱和刚果红染色法得到证实。这些结果表明，食品添加剂染料对食品工业中蛋白质的理化性质具有不利影响。
引言
酪蛋白（CSN）是牛奶中的一种基本蛋白质，在乳制品工业和人类营养中发挥着重要作用。酪蛋白具有多种技术功能特性，如乳化、凝胶化、粘度调节和薄膜形成等，使其在营养补充剂、奶酪生产、酪蛋白衍生生物活性肽、食品保存、强化剂以及膳食产品中至关重要（Broyard & Gaucheron, 2015）。酪蛋白被认为是一种均衡的食品成分，因为它含有碳水化合物、钙和磷等必需元素，九种必需氨基酸（其中亮氨酸含量丰富），以及较高比例的非必需氨基酸脯氨酸（Phelan et al., 2009; The Caseins’, 2018）。从结构上看，酪蛋白与典型的球状蛋白质不同，它缺乏明确的三级结构，主要以胶束形式存在，这使得其构象动态对环境条件非常敏感。内在因素（如氨基酸组成、翻译后修饰）或外在因素（如温度、溶剂质量、压力）的变化都会影响酪蛋白的技术功能特性和结构。酪蛋白的聚集在乳制品加工过程中被广泛利用，包括凝乳酶介导的κ-酪蛋白切割（Fagan et al., 2017）、pH诱导的聚集（Anema et al., 2004）、钙桥接（Acosta et al., 2025）和热处理（Dumpler, 2018）以及离子强度的变化（Harton & Shimizu, 2019）。尽管这些理化过程在食品工业中通常受到控制，但低分子量食品添加剂引起的聚集现象常被忽视，因为聚集会增加粘度、促进相分离并导致凝胶化，从而影响食品的质地和稳定性。然而，在生物系统中，酪蛋白的聚集与过敏和不耐受反应有关，可能导致消化问题和皮肤疹子。此外，酪蛋白聚集还会降低营养物质的利用率（Lara-Castellanos et al., 2021）。因此，研究酪蛋白聚集的非传统诱因非常重要。
人工食品着色剂在食品加工行业中被广泛使用，以增强食品的颜色和外观（Oplatowska-Stachowiak & Elliott, 2017）。过去二十年里，这些合成化合物的使用显著增加，因为它们比天然色素具有更高的稳定性、更广泛的颜色范围，并且更具成本效益（Li et al., 2023）。喹啉黄（QY）和阿鲁拉红（AR）常用于饮料、糖果、烘焙食品、海鲜、干混合料、调味品、水果制品、调味乳清饮料和儿童药品中（Fu et al., 2015; Q. Zhang et al., 2023）。欧洲食品安全机构建议QY和AR的每日可接受摄入量分别为每公斤体重0.5毫克和7毫克（Kwon et al., 2022; Wang et al., 2019）。研究表明，QY对人体健康有不良影响，例如导致儿童注意力不集中、行为冲动等（Gajda-Wyr?bek et al., 2017）。QY还被发现会导致DNA损伤、肿瘤和过敏反应（Gultekin & Doguc, 2013），而AR被认为是一种促炎性外源物质，会在大鼠肝脏和肾脏中引起氧化应激。肠道细菌会将AR代谢为游离芳香胺，这些芳香胺具有致癌性（Kwon et al., 2022）。多项研究探讨了染料与球状蛋白质之间的相互作用（Fatima et al., 2024; Hakeem et al., 2023; Khan et al., 2019; Wang et al., 2019）。关于这些染料与酪蛋白等内在无序蛋白质之间的相互作用，目前了解甚少。与具有明确刚性结合位点的球状蛋白质不同，酪蛋白具有内在无序的柔性构象，因此与食品染料相互作用时会产生不同的结合方式和聚集路径。这种根本差异导致了在酪蛋白等食品相关蛋白质中研究染料诱导聚集机制方面的知识空白。
本研究提供了关于人工食品染料与酸性环境中牛奶蛋白酪蛋白之间分子相互作用的新见解。例如，在调味酸奶中会使用酸度调节剂来抑制微生物生长并改善口感和质地。与以往主要关注染料毒性或简单蛋白质结合的研究不同，本研究通过多种生物物理方法全面展示了食品染料对酪蛋白构象变化的影响。这些发现揭示了食品着色剂对食品蛋白质构象稳定性和功能特性的影响，这是之前较少被探索的领域。
试剂
酪蛋白、磷酸二氢钠（二元碱）、磷酸一氢钠（一元碱）和甘氨酸购自Sisco Research Laboratory（印度孟买）。刚果红（CR）购自Sigma Aldrich（美国）。喹啉黄和阿鲁拉红购自Tokyo Chemicals（日本）。
样品制备
在pH 7.4的20 mM磷酸钠缓冲液中制备了5 mg/mL的酪蛋白储备溶液。将蛋白质在同一缓冲液中透析过夜，以去除盐分和防腐剂。
紫外吸收光谱测量
紫外吸收光谱是研究蛋白质与小分子相互作用时复合物形成和构象变化的基本技术（G. Zhang et al., 2009）。由于酪蛋白中含有芳香氨基酸残基（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸），其在280 nm处具有最大的吸收峰。我们测量了在不同QY和AR浓度（2-10 μM）下酪蛋白的吸收光谱，如图1所示。
讨论
酪蛋白是牛奶中的一种重要蛋白质，在乳制品工业中具有多种用途，如营养补充剂、奶酪生产、酪蛋白衍生生物活性肽、食品保存等（Phelan et al., 2009）。酸奶、冰淇淋、调味牛奶等乳制品利用食品染料来改善外观和颜色。研究表明，合成食品染剂会在体外诱导多种蛋白质的聚集和纤维化（Hakeem et al., 2023; Khan et al., 2023）。
结论
本研究表明，人工食品着色剂QY和AR在酸性条件下以浓度依赖的方式促进酪蛋白的聚集。导致聚集的主要力量是静电力和疏水性作用。进一步分析发现，当AR浓度达到QY浓度的一半（320 μM）时，它会引起酪蛋白转变为交叉β结构。因此可以得出结论，像QY和AR这样的阴离子染料具有潜在的……
CRediT作者贡献声明
Hamida Nasir：数据可视化、实验设计。Aabgeena Naeem：写作、审稿与编辑、验证、监督、资源管理、数据分析、概念构建。Neha Kausar Ansari：初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、实验实施、概念构建
未引用的参考文献
荧光光谱仪相关文献：2006; The Caseins, 2018.
伦理批准和参与同意
不适用
数据和材料的可用性
支持本研究的所有数据均包含在论文中。
利益冲突声明
作者声明在本研究中不存在任何利益冲突。
资助情况
本研究未接受任何外部资助。
致谢
作者衷心感谢阿里格尔穆斯林大学生命科学学院的生物化学系提供的实验设施。同时感谢USIF和AMU提供的扫描电子显微镜。N. K.A.获得了印度少数民族事务部资助的MANF-SRF项目支持。
