综述：基于CRISPR技术的阿尔茨海默病中载脂蛋白E4的修正：治疗策略与大分子递送创新

《International Journal of Biological Macromolecules》：CRISPR-based correction of apolipoprotein E4 in Alzheimer's disease: Therapeutic strategies and macromolecular delivery innovations

阿尔茨海默病APOE4基因编辑研究综述CRISPR技术通过基因敲除、碱基编辑和prime编辑实现APOE4向APOE3特异性校正，纳米颗粒和细胞外体递送系统是突破血脑屏障的关键，但存在Cas酶免疫原性、递送效率及长期基因组安全性等挑战。

　　

王明梅|牛 Dou|张庆成|唐玉琪|赵毅|陈峰

中国江苏省苏州市苏州工业大学生物与食品工程学院，215500

摘要

阿尔茨海默病（AD）是全球痴呆症的主要原因，存在大量未满足的临床需求。载脂蛋白E4（APOE4）等位基因是晚发性AD最强的遗传风险因素，每个APOE4等位基因拷贝会使风险增加约2到3倍，而纯合子携带者的风险比APOE3携带者高10到15倍。APOE4通过多种病理机制导致疾病，包括脂质失调、神经炎症、突触功能障碍和血管损伤。因此，针对APOE4的精确、等位基因特异性校正具有变革性的治疗潜力。基于CRISPR的基因编辑技术，如核酸酶破坏、碱基编辑和引导编辑，为直接在其基因组源处修改APOE4提供了前所未有的机会。本文综述了APOE4病理机制的基础，总结了当前的APOE4校正基因编辑平台，评估了相关的体外和体内模型系统，并重点探讨了基于纳米粒子和外泌体的递送策略。我们强调了外泌体介导的APOE4编辑的最新进展，同时指出了在等位基因特异性和技术转化方面仍存在的一些挑战，如Cas核酸酶的免疫原性、跨血脑屏障（BBB）的递送效率有限以及长期基因组安全性的担忧。本综述认为，克服BBB限制仍是临床转化的最大挑战，而基于外泌体和纳米粒子的递送平台的创新代表了推进AD CRISPR治疗的最有前景的策略。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种与年龄相关的进行性神经退行性疾病，占全球痴呆症病例的大多数[1]。其社会影响深远且日益严重：仅在美国，就有约690万65岁及以上的老年人患有AD[2]。全球范围内，痴呆症的患病人数已超过4000万，并预计到2050年将超过1.5亿[3]。尽管经过数十年的深入研究，目前尚无获批的治疗药物能够阻止或逆转AD的神经退行性进程[4]。组织病理学上，AD的特点是细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的积累和细胞内由过度磷酸化的tau蛋白组成的神经纤维缠结[5]。然而，越来越多的证据表明AD是一种多因素疾病，由遗传、血管、代谢和炎症因素的复杂相互作用引起，这增加了开发有效疾病修饰治疗的难度[6],[7],[8]。

遗传易感性是AD风险的主要决定因素，尤其是在散发性、晚发性AD中。在遗传因素中，载脂蛋白E基因（APOE4）的ε4等位基因是最强且最可重复的风险因素[9]。大约10-15%的普通人群至少携带一个APOE4等位基因，每个等位基因会使AD风险增加约2到3倍，而纯合子携带者的风险比APOE3中性变异体的纯合子携带者高10到15倍[10]。除了增加风险外，APOE4还会加速淀粉样蛋白沉积，加剧tau蛋白病理变化，促进神经炎症，并导致脑血管功能障碍[11]。尽管APOE4在病理过程中起关键作用，但目前尚无针对其介导机制的治疗干预措施[9]。重要的是，APOE4同时作为多个病理级联反应的上游驱动因素，连接了淀粉样蛋白、tau蛋白、脂质代谢、神经炎症和血管损伤[12],[13],[14],[15]。其影响在临床症状出现前几十年就已显现，使其成为疾病进程的关键早期决定因素。此外，由于其致病性由单一核苷酸多态性（rs429358）决定，APOE4非常适合通过基因编辑进行等位基因特异性校正[16]。因此，这些特征使得将APOE4作为关键干预点成为可能，即使在多因素疾病的背景下也是如此。

CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一种变革性工具，有可能重塑遗传性疾病（包括AD）的治疗策略[17]，它利用引导RNA将Cas9核酸酶引导至特定的基因组位点，从而实现对基因组DNA的精确、可编程的修改[18]。CRISPR彻底改变了分子生物学，推动了基础研究的重大进展，并促进了新型治疗方法的开发[19]。目前正在进行针对癌症和单基因疾病的基于CRISPR的临床试验，这表明基因编辑作为一种治疗方式是可行的[20],[21]。在AD背景下，CRISPR技术提供了直接在其基因组源处校正APOE4等位基因的前所未有的机会，有可能缓解甚至预防疾病进展[22]。同时，碱基编辑技术的进步进一步拓宽了CRISPR方法的治疗潜力，扩展了神经退行性疾病中等位基因特异性校正策略的范围[23]。

尽管仍处于早期开发阶段，但将CRISPR介导的编辑应用于AD模型的临床前研究已经取得了有希望的结果。最近的研究表明，在人类来源的神经细胞中将APOE4转换为APOE3可以改善与APOE4表达相关的关键病理特征[24]。更广泛地说，CRISPR干预在多种神经退行性疾病模型中显示出恢复细胞稳态和改善疾病表型的潜力[25]。因此，通过基因编辑靶向APOE4代表了一个大胆且创新的治疗前沿[26]。基于CRISPR的编辑方法可以在临床症状出现前几十年就干预AD的分子驱动因素，将AD治疗的范式从症状管理转变为真正的疾病预防。以下部分将系统地回顾当前的基于CRISPR的APOE4编辑策略，讨论主要的技术和转化障碍，并探讨这些技术在改变AD病程方面的变革潜力。

APOE4在AD中的病理机制：结构、代谢和细胞层面

APOE4具有独特的结构构象，这是其在AD中发挥病理作用的基础。112位点的精氨酸替换导致apoE蛋白的受体结合区域和脂质结合区域之间的异常相互作用，使APOE4比APOE3采用更紧凑、更刚性的折叠结构[27]。这种构象重排降低了APOE4的稳定性和脂质化效率，减少了其与脂蛋白受体的亲和力，并增加了其

基于CRISPR的APOE4编辑方法

基于CRISPR的基因编辑技术的出现改变了AD的治疗格局，使得可以直接在其源头校正致病突变。其中，APOE4等位基因是一个突出的目标，因为它与APOE3只有一个核苷酸的不同，并且是晚发性AD风险的主要贡献因素。三种主要的CRISPR/Cas9方法——破坏、碱基编辑和引导编辑——提供了不同的机制、治疗效果和转化潜力

用于研究APOE靶向CRISPR编辑的模型系统

基于前一节中概述的CRISPR策略，已经开发了多种模型系统来评估它们在APOE4校正方面的有效性、递送效果和功能影响。虽然啮齿动物和iPSC衍生的模型提供了宝贵的机制见解，但它们的生理局限性需要更符合临床转化需求的平台。大型动物和非人灵长类（NHP）模型通过更接近人类神经解剖结构和脂质

针对APOE4的CRISPR治疗的递送平台

在多种模型系统中开发和验证基于CRISPR的APOE4校正策略，强调了向中枢神经系统（CNS）高效和靶向递送的必要性。随着治疗转化的推进，克服将基因编辑工具递送穿过血脑屏障（BBB）这一重大挑战变得至关重要。这些递送考虑构成了以下部分的重点。

针对AD中APOE4校正的细胞类型特异性CRISPR编辑策略

基于CRISPR的技术的出现彻底改变了AD潜在治疗干预的格局，特别是在APOE4风险等位基因的背景下。然而，CNS的异质性细胞结构要求采用细胞类型特异性的方法，因为APOE4在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中表现出不同的病理效应[159]。最近的研究阐明了APOE4驱动的细胞内在分子机制，从而为合理

通过基于CRISPR的基因组编辑校正APOE4的分子机制

基于CRISPR的基因组工程的出现改变了AD研究的格局，使得可以直接操纵以前无法通过治疗干预触及的致病等位基因和因果分子途径。CRISPR既可作为实验探针，也可作为精确的治疗工具，允许系统地解析和校正疾病机制的遗传起源。在这一框架下，APOE4作为晚发性AD最强的遗传风险因素

CRediT作者贡献声明

王明梅：撰写——原始草稿。牛 Dou：软件支持。张庆成：软件支持。唐玉琪：软件支持。赵毅：数据整理。陈峰：撰写——审稿与编辑，监督。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金青年科学基金（项目编号：82404609）、南通大学临床医学专项研究基金（项目编号：2024JY004）、南通市科学技术局社会与民生科学技术计划（项目编号：MSZ2024123）以及南通市卫生健康委员会专项研究计划（项目编号：QN2024013）的资助。