《ACS Food Science & Technology》：Valorization of requesón Cheese Whey through Synthesis of Galactooligosaccharides with Fungal and Recombinant β-Galactosidases
编辑推荐：
本文评估了利用墨西哥传统干酪“雷克松”生产中产生的乳清废水（RW）作为乳糖来源，通过真菌（β-gal-Ao）和重组超嗜热糖苷酶（GLY 001–02）催化转半乳糖基反应合成高价值益生元成分——低聚半乳糖（GOS）的技术潜力。通过响应面法优化，在RW中实现了超过40%的GOS产率，证明该废弃物可作为功能性食品配料生产的可行原料，为乳品工业废弃物的循环经济利用提供了创新方案。
引言
乳清是干酪生产过程中酪蛋白凝固产生的副产品，因其含有高浓度的可溶性蛋白质和乳糖，具有高生物需氧量（BOD），构成显著的环境挑战。全球范围内，乳清主要用于生产浓缩乳清蛋白（WPC）。在墨西哥，乳清则常用于动物饲料或用于生产一种称为“雷克松”的乳清干酪。雷克松的生产涉及通过发酵或直接添加有机酸（如乳酸）对乳清进行酸化，随后加热诱导蛋白质沉淀，形成一种柔软、白色的凝块。这个过程会产生一种名为雷克松乳清（RW）的副产品，其乳糖浓度（4-5%）在过程中保持不变，因此RW保留了大量的乳糖，构成了一个具有环境意义的二次废物流。
在乳糖衍生的高价值化合物中，低聚半乳糖（GOS）尤为引人注目。这些寡糖由通过β-糖苷键连接的半乳糖单体组成，可能含有一个末端葡萄糖单元，其聚合度（DP）通常在2到9之间。GOS具有特定的生物活性功能，如益生元活性和促进矿物质（特别是钙）吸收，这激发了工业界的巨大兴趣。GOS主要通过使用β-半乳糖苷酶的酶法合成生产，该酶的主要功能是将乳糖水解为其组成的单糖：半乳糖和葡萄糖。然而，它们也可以在受控条件下进行反向过程，即转半乳糖基反应，将半乳糖基团转移至一个乳糖、半乳糖或现有GOS分子上，从而合成新的GOS。由于乳糖浓度是主要限制因素，而乳糖溶解度随温度升高而增加，因此探索使用嗜热和超嗜热酶以实现高底物负载过程、提高生产率并缓解工业GOS生产中的溶解度限制。
材料与方法
本研究利用两种商业糖苷酶通过转半乳糖基反应合成GOS：来自米曲霉的β-半乳糖苷酶（β-gal-Ao）和重组超嗜热糖苷酶（GLY 001–02）。它们在高温下的最佳活性（分别为50°C和>90°C）有利于反应介质中更高浓度乳糖的溶解。值得注意的是，β-gal-Ao在酸性条件下（最适pH 4.5，包括RW的pH 4.5–5.0）具有活性并表现出嗜盐性。而GLY 001–02在有机介质中曾产出超过45%的GOS。
为评估RW作为GOS合成底物的适用性，研究首先在实验室条件下制备了RW并对其进行了表征，包括总碳水化合物、可溶性蛋白质含量、灰分和钙含量的测定。通过响应面方法论，以初始乳糖浓度和温度为变量，优化了使用RW作为底物的转半乳糖基反应条件。酶活性通过水解邻硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（ONPG）并监测邻硝基酚（ONP）的释放来测定。GOS合成反应在特定条件下进行，并通过高效液相色谱法（HPLC）对反应混合物中的碳水化合物（乳糖、半乳糖、葡萄糖和GOS）进行定性和定量分析。GOS产率（Y）计算为获得的总GOS摩尔数占初始乳糖摩尔数的百分比。
结果与讨论
雷克松乳清（RW）的表征
RW的分析结果显示，其总固形物含量为6.79 ± 0.09%，总糖含量为5.23 ± 0.36%，其中通过HPLC分析确认乳糖是唯一的糖分。蛋白质含量极低，为0.03 ± 0.00%，这与乳清干酪生产过程主要沉淀可溶性蛋白质的性质一致。灰分含量为1.28 ± 0.10%，钙浓度为75.00 ± 0.05 mM。这些数值与文献中报道的其他二次乳清（如意大利里科塔干酪乳清，scotta）的成分范围相似，证实了RW中乳糖含量超过4%，是酶法转半乳糖基反应的可行底物。然而，二次乳清成分的变异性，特别是二价阳离子（如钙）的存在，可能对某些酶产生抑制，这是需要考虑的挑战。
GOS的合成
使用缓冲液中的乳糖合成GOS
首先评估了两种酶在缓冲液中使用18%乳糖合成GOS的能力。两种酶均显示出对GOS-3和GOS-4的强产物选择性，二者合计占检测到总GOS的85%以上。使用β-gal-Ao时，在反应30小时后可检测到DP-5的GOS，并随时间延长而增加，这支持了级联合成机制。GOS浓度在24小时内持续增加，然后在36小时下降，这可能归因于GOS产物的二次水解。β-gal-Ao在30小时实现了47.20 ± 0.01%的总GOS产率，其比生产力为14.93 g GOS·mg蛋白质-1·h-1。酶GLY 001–02表现出更高的比生产力和产率，在反应30小时后分别达到30.31 g GOS·mg蛋白质-1·h-1和66.64 ± 0.02%的总GOS产率，超过了文献中许多使用嗜热酶的报道。
使用雷克松乳清（RW）合成GOS
在确立了缓冲液中的反应条件后，评估了使用复水RW作为乳糖来源的酶促反应。对于β-gal-Ao，RW介质中的GOS生产动力学与使用乳糖缓冲液作为底物时接近。在RW中，GOS-3的产量在24小时达到峰值，随后下降，而GOS-4的积累更早且更高。在24小时，β-gal-Ao在RW中实现了43.28 ± 0.02%的GOS产率和17.29 g GOS·mg蛋白质-1·h-1的比生产力，与在乳糖缓冲液中（42.23%和16.49）无显著差异，表明RW中的离子存在并未显著改变β-gal-Ao的活性。
相反，酶GLY 001–02在反应介质从乳糖缓冲液改为RW时显示出显著抑制。尽管GOS-4浓度增加了近50%，但GOS-3水平以相似幅度下降，导致总GOS含量从184.18 mg/mL降至133.63 mg/mL，总体减少约28%。这种抑制可归因于RW中某些阳离子的存在，特别是钙离子（浓度为75 ± 0.05 mM）。文献报道，低至5 mM的Ca2+和Na+就会对该酶产生抑制。尽管如此，GLY 001–02在RW中仍实现了44.00 ± 0.00%的GOS产率和24.86 g GOS·mg蛋白质-1·h-1的比生产力，虽然低于其在缓冲液中的表现（61.68%和34.55），但仍高于许多文献报道的GOS合成产率（通常在40%左右）。
转半乳糖基反应的优化
使用中心复合设计优化了以RW为底物的转半乳糖基反应，变量为温度和初始乳糖浓度。
对于β-gal-Ao，响应面分析确定了总GOS合成的最佳条件为52.56°C和22.73%的初始乳糖浓度，此时GOS浓度为153.13 ± 1.43 mg/mL，产率为44.35 ± 0.00%。分析还显示，GOS-4合成（51°C， 22.6%乳糖）比GOS-3合成（47.8°C， 23.5%乳糖）需要稍高的最佳温度，这提示受体分子的大小可能影响酶的温度-活性曲线。
对于糖苷酶GLY 001–02，优化研究揭示了在不同初始乳糖浓度下，GOS-3和GOS-4合成有不同的最佳温度。GOS-3的最佳条件为83.5°C和23%初始乳糖，而GOS-4合成则需要更高的最佳温度88°C（乳糖浓度同样为23%），这再次印证了合成更高DP的GOS可能需要更高温度以诱导酶活性位点更大的结构灵活性。总GOS的最高浓度在84°C、23%初始乳糖条件下实现，产生了217.54 ± 0.62 mg/mL的GOS浓度和61.56 ± 0.00%的产率。尽管使用的是成分更复杂的RW介质而非纯乳糖缓冲液，但优化后的GOS合成产率超过了文献中报道的绝大多数β-半乳糖苷酶催化反应的值。
结论
本研究成功证明了RW作为GOS生产可持续底物的价值化潜力。使用两种商业糖苷酶（β-gal-Ao和GLY 001–02）均实现了超过40%的GOS产率。通过响应面方法学优化，确定了各自的最佳条件，分别获得了44.35%（β-gal-Ao：52.56°C， 22.73%乳糖）和61.56%（GLY 001–02：84°C， 23%乳糖）的GOS产率，代表了从乳制品废物流中酶法合成GOS的极高产率水平。RW中GOS-4的形成增强，表明基质可能诱导了酶选择性的改变，这值得进一步的机理研究。总体而言，这些结果确立了RW作为商业乳糖的可行且具有经济吸引力的替代品，用于生产益生元GOS，支持了乳品加工领域的循环经济原则。未来的工作应通过酶工程或螯合策略解决钙离子抑制问题，验证GOS的生物活性，并进行工业实施的技术经济分析。
