《Frontiers in Immunology》：Midgestational injection of highly expanded human CD34+ cells increases lineages of human immune cells and supports thymic development in RAG2-/-IL2RG-/Y SCID pigs
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本研究通过优化人脐带血CD34+造血干细胞（hHSC）的体外扩增方案，将其在妊娠中期（孕期第41-42天）腹腔注射入RAG2-/-IL2RG-/Y双基因敲除重症联合免疫缺陷（SCID）猪胚胎。与既往低细胞剂量方案相比，20-40百万的高剂量细胞显著提升了新生仔猪外周血、脾脏、骨髓及胸腺中人源白细胞（hCD45+）的嵌合水平，并成功分化为T细胞、B细胞、NK细胞及髓系细胞等多种谱系。尤为重要的是，人源细胞促进了SCID猪胸腺皮质与髓质的结构性发育。本工作为建立更完善的宫内人源化SCID猪大动物模型提供了重要方法学改进，在癌症免疫治疗、干细胞疗法等临床前研究领域具有应用潜力。
1 引言：寻求更优的人源化大动物模型
生物医学研究长期以来一直在寻找能更准确模拟人类生理与疾病过程的动物模型。虽然人源化小鼠模型（通过注射人外周血单个核细胞（PBMCs）、造血干细胞或胎儿骨髓、肝脏、胸腺细胞）已被广泛应用，但由于小鼠与人在体型、寿命、生理特别是免疫学上存在显著差异，其研究成果向人类应用的转化常常受限。近年来，猪因其在解剖、生理和遗传上与人类更为接近，已成为一种前景广阔的大动物模型。
重症联合免疫缺陷（SCID）猪的出现是该研究领域的突破。这类动物缺乏功能性的适应性免疫系统，通过最小化宿主免疫系统的排斥，为研究人类疾病和测试新型疗法提供了独特平台。通过基因工程技术，特别是CRISPR/Cas9，靶向特定免疫相关基因组合（如DCLRE1C与IL2RG，或RAG1/RAG2与IL2RG的组合敲除）来开发SCID猪已成为可能。通过将人造血干细胞（hHSC）植入SCID猪体内，研究人员旨在重述人免疫细胞库，并在生理相关的大动物模型中产生能代表人类免疫反应的应答，这对于研究人类特异性疾病、测试免疫疗法以及理解复杂免疫互作具有巨大潜力。
然而，现有的人源化SCID猪模型常常缺乏显著的淋巴细胞发育证据。例如，早期研究使用DCLRE1C-/-; IL2RG-/Y模型并在胎儿期注射hHSC，仅在血液和胸腺中检测到中低水平的人T细胞及极少量B细胞。近期，有研究通过创建RAG1-/-;IL2RG-/Y双突变体（RG）及进一步敲除CD47基因的三重突变体（RGD），并在出生后（post-natal）注射CD34+ hHSC，在RGD品系中报告了更高水平的人源化，包括胸腺、脾脏和骨髓中大量的B细胞和T细胞。但出生后注射方案需要长时间维持对疾病易感的仔猪，以待其成熟和人免疫系统发育。为了测试在免疫组织完全发育之前（即更早期）注射更大剂量扩增细胞的效果，本研究对先前方案进行了多项调整。
2 材料与方法：构建与优化人源化SCID猪模型
2.1 通过体细胞核移植（SCNT）创建动物
研究首先针对RAG2和IL2RG基因成功设计了CRISPR引导RNA（crRNA），并建立了双基因敲除（RAG2-/-IL2RG-/Y, RG）的细胞系。通过体细胞核移植技术，利用该细胞系克隆出SCID猪胎儿，用于后续的人源化实验。
2.2 细胞的扩增
为了将每次注射的细胞量提升至20-40百万，研究采用了改良的Boitano等已发表方案对人脐带血（UCB）来源的CD34+细胞进行扩增。细胞在含有SCF、Flt3L、IL-6、TPO、SR-1和UM729等细胞因子的培养基中扩增21天，常规可获得超过100-200倍的细胞数量增长，且造血干细胞（HSC）表型（CD34+CD45+CD38-CD45Ra-CD90+）比例未见显著变化。每次胎儿移植准备2500万或5000万细胞，最终确保每次注射的活细胞数为2000万或4000万。
2.3 胎儿肝脏注射手术
怀孕母猪在妊娠第41-42天接受胎儿肝脏注射手术。手术在无菌条件下进行，通过腹部中线切口将子宫外置，利用超声定位所有胎儿并标记。选择目标胎儿，在超声引导下经子宫壁将细胞悬液注射入胎儿的肝内/腹腔内。注射过的胎儿通过在子宫壁上缝线进行标记。手术后母猪恢复顺利，所有接受注射的母猪均未发生流产。
2.4 剖腹产获取仔猪及样本采集
注射手术后，母猪被维持妊娠至第119天，通过剖腹产分娩仔猪。根据子宫壁上的标记识别每只仔猪先前接受的细胞注射处理。大部分仔猪在出生后约30分钟被实施安乐死，以收集血液和组织样本（包括胸腺、脾脏、骨髓、肝脏、肺等），用于流式细胞术分析和组织学检查，旨在记录人源化水平并尽量减少猪固有先天免疫系统对人细胞存活的影响。部分窝次（30和31号窝）的仔猪被饲养一周后取样。
2.5 组织处理与流式细胞术
组织样本经过机械剪切、过滤制备成单细胞悬液。血液和组织样本经过红细胞裂解、洗涤后，用针对人和猪特异性抗原的抗体组合进行染色。使用的人源细胞标志物抗体包括：hCD45、hCD3、hCD4、hCD8、hCD19、hCD56、hCD163等，猪源标志物为pCD45。染色后的细胞用流式细胞仪进行分析，并使用FlowJo软件处理数据，通过设门策略区分活细胞、单细胞、人/猪白细胞，并进一步分析人源T细胞、B细胞、髓系细胞等亚群。
2.6 组织学分析
淋巴组织样本用福尔马林固定，石蜡包埋切片，进行H&E染色以及免疫组织化学染色。使用抗CD3ε抗体标记人T细胞，抗Pax5抗体标记人B细胞，以评估这些细胞在胸腺、脾脏等组织中的存在与分布。
3 结果：高剂量宫内注射显著提升人源化水平
3.1 细胞扩增增加了克隆RG SCID猪的人源化机会
研究成功将脐带血CD34+细胞扩增了100-200倍，且保持了HSC表型比例。在五窝SCID猪中，共对15个胎儿进行了注射（包括少量CAR-T转基因细胞试验），其中12个胎儿注射了未修饰的人CD34+细胞。所有接受注射的窝次均成功维持妊娠至足月。
3.2 注射2000万及以上扩增细胞改善了SCID猪的人源化
流式细胞术分析显示，在未注射的对照猪组织中未检测到人源细胞（hCD45+）。而在注射了人细胞的仔猪中，多种组织检测到了显著水平的人源淋巴细胞。以一只注射了2000万细胞的仔猪（#30-3）为例，其胸腺中出现了大量人源T细胞（hCD45+CD3+）和B细胞（hCD45+CD19+）。与之前使用1-2百万细胞进行产前注射的研究（胸腺hCD45+水平为53-58%）相比，本研究获得的细胞数量显著更高。
在12只注射了未修饰人CD34+细胞并活产的仔猪中，11只在其胸腺组织中通过流式检测到了至少微量水平的人源白细胞。研究人员定义了两种人源化类别：第一类为“人源化”，其胸腺白细胞群体中hCD45+细胞占比大于5%；第二类为“极低”，hCD45+细胞占比在0.32%至2.5%之间。在“人源化”组中，组织含有相对较高的CD3+ T细胞及其CD4+、CD8+亚群，而CD19+和CD163+细胞比例较低或为零。
胸腺：在“人源化”组动物中，胸腺人源细胞比例较高（7.3%至89%），且以T细胞为主。
脾脏：脾脏中hCD45+细胞比例普遍低于同只动物的胸腺。在胸腺“人源化”的动物中，脾脏也多显示人源化，且T细胞比例高于B细胞。在“极低”组中，B细胞比例相对较高。
骨髓：在胸腺人源化水平最高的动物中，骨髓中hCD45+人源细胞比例稳定在6-7%左右，其中大部分（50-80%）为CD19+ B细胞，另有相当部分（18-45%）为CD163+髓系细胞。
血液：仅5只动物血液中检测到可被视为植入水平的人源细胞（3-17%），且CD3+ T细胞比例高于CD19+ B细胞。
3.3 胎儿期人源化实现一致的胸腺人源化与结构发育
组织学分析进一步证实了人源化的效果。注射了人CD34+细胞的SCID猪，其胸腺显示出显著的正常组织结构。例如，注射了2000万细胞的#30-3号猪，其胸腺呈现由髓质和皮质组成的大叶结构，其中充满了密集的小T细胞。相比之下，未注射的SCID猪胸腺明显发育不全，小叶小，淋巴细胞稀少，无法区分皮质和髓质。
同样，在人源化猪的脾脏中，可见主要由T细胞组成的动脉周围淋巴鞘（PALS）包绕中央动脉，以及类似早期初级滤泡的B细胞小聚集。未注射猪的脾脏则未观察到显著的脾脏结构发育。这些分析表明，在RAG2-/-; IL2RG-/Y猪中产前注射2000万或更多的hHSCs，可导致人多细胞谱系在多种组织中的广泛分化。
4 讨论：优化方案推动人源化SCID猪模型发展
本研究通过优化产前细胞移植方案，在SCID猪模型人源化方面取得了重要进展。在妊娠第41-42天（猪造血发育的关键时期）向RG SCID胎儿注射20-40百万扩增的人CD34+脐带血细胞，成功在超过一半的活产仔猪中实现了实质性人源化（>5% hCD45+细胞）。与早期使用更低细胞剂量的尝试相比，该方法显著改善了淋巴组织重建。
数据表明，胸腺中人造血细胞与发育中的猪胸腺微环境发生了互作，支持了人T细胞在猪胸腺内的发育。本研究观察到的胸腺结构恢复程度，与Hu等在其出生后注射的三敲除（RGD）模型中所报告的结果相似。这可能是因为本研究的人源细胞在更早期就存在于猪胸腺，提供了与胸腺上皮细胞互作的重要信号。
尽管在实现强劲的B细胞和髓系谱系重建上仍有挑战，但本研究的方法避免了使用胎肝组织或任何预调理（如全身照射），并证明了在出生时即可建立大量、多种类型的人免疫细胞。使用脐带血来源的体外扩增hHSC也扩展了该方法的适用性。
本研究也存在局限性，主要集中于对这些人工细胞的流式细胞术分析。未来的研究将侧重于检测人源细胞在出生后的进一步分化和功能，包括对有丝分裂原刺激的反应和抗原特异性免疫的评估。将本方法与更大体型猪种以及CD47敲除相结合，可以进一步研究人免疫细胞亚型的长期存活与功能，以开发出能更好再现人类免疫系统的生物医学模型。
总结而言，本文描述的方法为改进人源化SCID猪模型增添了新策略。随着不断优化，人源化SCID猪模型有望成为一个生理相关的转化研究平台，用于以现有啮齿动物模型无法实现的方式，研究人造血、免疫反应及治疗干预。
