《Frontiers in Plant Science》：Genotype-flexible plant genetic transformation: advances and prospects
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这篇综述系统梳理了当前主流的植物遗传转化平台，并聚焦于新兴的组织培养（TC）游离策略（如花器浸染、切-浸-芽CDB、活体注射RAPID/GiFT、病毒载体VIGE等），旨在克服基因型依赖性瓶颈。核心在于探讨多种发育调节因子（DRs）（如WUS/BBM、GRF-GIF、DOF、LAX1、PLT、WIND1）在通过染色质重塑、生长素梯度建立和细胞重编程来增强再生效率中的作用，并提出了通过启动子优化和自动切除系统实现瞬时、精准控制DRs表达，以整合这些进展、实现适用于分子设计育种的基因型灵活、高通量转化的路线图。
在当代作物分子设计育种中，如何将外源DNA（包括合成表达盒或跨界序列）稳定、可遗传地整合到植物核基因组或细胞器基因组中，产生具有理想性状的转基因品系，是一个核心目标。传统方法，如基因枪（粒子轰击）和农杆菌介导的转化，虽然广泛应用，但普遍受到基因型特异性顽固和严重依赖体外组织培养的制约。这篇综述旨在探索如何突破这些瓶颈，实现更灵活、高效的植物遗传转化。
传统植物遗传转化系统
传统系统主要包括粒子轰击介导的转化和农杆菌介导的转化。粒子轰击是一种物理递送技术，利用高速金属颗粒（金或钨）将DNA直接送入植物细胞。这种方法对单子叶植物（如水稻、玉米、小麦）尤其有效，但存在操作繁琐、成本高、转基因拷贝数多、随机整合导致基因沉默等显著缺点。
相比之下，农杆菌介导的转化利用土壤农杆菌的天然水平基因转移机制，能够实现低拷贝数、稳定遗传的T-DNA整合，序列重排少，是植物生物技术中最可靠、高效的工具之一。其成功应用已从双子叶植物（如烟草、番茄）扩展到多种单子叶作物（如水稻、玉米、小麦、甘蔗）。然而，其效率在不同基因型和品种间差异巨大，许多商业优良品种表现出再生能力差的问题，限制了其广泛应用。
新兴的无组织培养转化平台
为了摆脱对复杂体外组织培养的依赖，研究人员开发了多种无组织培养或最小化组织培养的转化策略。
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基于花器官的转化：主要包括“花器浸染法”和“花粉管通道法”。花器浸染法操作简单，在拟南芥和一些双子叶植物中成功，但在主要禾谷类作物中效率低且不稳定。花粉管通道法利用植物自身的生殖机制，将外源DNA通过花粉管递送至受精卵，理论上具有基因型独立性，已在棉花、花生、玉米中取得一定成功，但其转化效率低和重复性差是主要挑战。
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切-浸-芽（CDB）方法：该方法利用发根农杆菌的Ri质粒，在非无菌条件下直接诱导茎段伤口处产生再生芽，从而绕过无菌组织培养。该方法已在甘薯、鹰嘴豆、俄罗斯蒲公英和柑橘中成功应用，用于CRISPR/Cas9基因编辑。但其主要局限在于仅限于具有根出条能力的物种，且转化效率因物种而异。
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活体注射递送系统：包括再生活性依赖性活体注射递送（RAPID）系统和基因型独立快速转化（GiFT）系统。RAPID系统将农杆菌悬液直接注射到甘薯茎段或马铃薯块茎等分生组织区域，利用植物内在的再生能力，在3-10周内获得转基因植株，效率可达12.5–40%。然而，它严格依赖具有活跃分生组织再生能力的无性繁殖双子叶物种。GiFT系统则针对大豆等种子繁殖作物，通过在萌发种子子叶节分生组织可接触的特定发育窗口进行农杆菌接种，结合亚致死除草剂筛选，成功转化了包括顽固商业品种在内的11个大豆品种，平均效率达24.5%，将转化周期从通常的91天缩短至35天。
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病毒介导的植物遗传转化：利用工程化的植物病毒（如烟草脆裂病毒TRV、大麦条纹花叶病毒BSMV）作为载体，在植物体内系统性递送基因编辑组件。传统病毒诱导基因编辑（VIGE）系统存在递送容量限制、瞬时表达以及需要预存Cas9转基因受体等局限。近年来，通过将病毒载体与开花位点T（FT）基因融合，或将超紧凑型核酸酶（如TnpB、AsCas12f）包装进病毒载体，已成功在拟南芥、本氏烟、番茄等植物中实现了可遗传的、无转基因痕迹的编辑。然而，病毒宿主特异性、进入分生组织效率以及在不同作物（特别是主要禾谷类和豆类）中的适用性仍是待突破的瓶颈。
植物发育调节因子的探索与应用
植物再生诱导是成功遗传转化的先决条件。一系列发育调节因子（DRs）被证明能显著增强多种植物的再生效率。
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BBM和WUS：BBM是AP2/ERF转录因子家族成员，是体细胞胚胎发生的主调控因子，通过激活LAFL胚胎身份调控网络驱动胚胎能力建立。WUS编码同源域转录因子，是维持茎尖分生组织（SAM）干细胞特性的关键。研究表明，ZmBBM和ZmWUS2的协同表达能将玉米转化效率提升至50%，并在高粱、籼稻、甘蔗等顽固作物中验证有效。在大麦中，HvWUS和HvBBM2的共表达也显著提高了再生和转化效率。
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GRF-GIF嵌合体：通过融合GRF的DNA结合域和GIF的转录激活域构建的合成嵌合蛋白（如TaGRF4-TaGIF1），能强力激活细胞增殖，显著提高小麦、黑麦、水稻、柑橘等多种作物的转化效率，并缩短转化周期。
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DOF转录因子：植物特有的DOF转录因子（如TaDOF5.6和TaDOF3.4）被鉴定为小麦再生调控网络的核心，能显著提高多种小麦品种的愈伤组织诱导频率和遗传转化效率。
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LAX1：编码生长素流入载体，其过表达通过直接激活TaGRF4和TaGIF1的转录，促进细胞分裂素积累和生长素信号响应，从而增强小麦、玉米、大豆的再生能力和转化效率。
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PLT因子：作为AP2/ERF转录因子，PLT家族成员（如PLT5）在调控再生和器官发生中发挥关键作用。研究发现，PLT和WOX家族因子的协同表达是触发体细胞胚胎发生和植物再生的核心调控枢纽，甚至可建立不依赖外源激素的再生系统。
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WIND1：是伤口诱导细胞重编程和去分化的主调控因子。近期研究发现了伤口应答信号分子再生因子1（REF1），它被受体激酶PORK1识别后，触发WIND1表达，进而通过细胞分裂素信号通路启动组织修复和器官再生程序。外源施加REF1可显著提高番茄、大豆、小麦、玉米的再生和转化效率。
利用DRs克服遗传转化中的基因型依赖性及其副作用控制
尽管DRs能强力提升再生和转化效率，但其异位表达常导致严重的多效性发育缺陷，如植株矮化、完全不育、器官畸形等，这限制了其实际应用。因此，实现对DRs的精准时空控制至关重要。
当前策略包括：1）使用组织特异性或诱导型启动子：例如，用胚性愈伤组织特异性启动子ZmPLTP驱动TaGRF4-TaGIF1表达，使其仅在再生阶段活跃，在成熟植株中沉默，从而获得表型正常的转基因植株。2）构建自动切除系统：在载体中整合热激诱导的Cre/loxP重组系统，再生完成后通过热激触发Cre表达，将DRs表达盒从基因组中精确切除，得到无残留调节因子的编辑植株。3）利用伤口响应通路：将DR基因（如异戊烯基转移酶ipt）置于WIND1的下靶标ESR1启动子控制下，使其表达严格限于伤口和再生部位，与CRISPR/Cas9系统结合可实现无组织培养的基因编辑和器官再生。此外，小分子调节剂如腺苷一磷酸（AMP）也被发现可通过激活PLT信号通路来增强多种植物的再生能力。
结论与展望
高效、稳定的遗传转化和基因编辑是植物分子设计育种的关键瓶颈。虽然DRs和无组织培养策略带来了突破，但当前基因型灵活转化系统主要在校禾类作物和部分豆类中得到验证，在油料作物、园艺物种和木本多年生植物中探索有限，且商业优良品种的转化能力普遍低于模型基因型。未来研究需着重于：1）系统解析不同作物转化顽固性的分子基础；2）发掘和验证具有广谱适用性的新型DRs及小分子调节剂（如REF1、AMP）；3）将DR介导的活体再生与精简、无培养的DNA递送方式（如直接分生组织注射、工程病毒载体）协同整合，并通过组织特异性、诱导型或伤口响应型启动子以及自动切除盒实现对DRs的精准时空控制。发展真正意义上的基因型灵活植物遗传转化技术，将充分释放CRISPR介导的基因组编辑和合成生物学在作物改良中的潜力，助力快速培育出气候韧性强、高产、营养丰富的作物品种，以应对全球粮食安全挑战。
