《Frontiers in Immunology》：Inosine alleviates colorectal cancer liver metastasis by promoting M1 macrophage polarization and modulating the PI3K/AKT signaling pathway
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本篇研究揭示了内源性嘌呤核苷—肌苷（IS）在结直肠癌肝转移（CRLM）中的新作用机制。研究表明，肌苷不仅能直接抑制多种结直肠癌细胞（如MC-38、CT-26、HT-29）的侵袭能力，还能通过重塑肿瘤微环境（TME），促使肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向具有抗肿瘤作用的M1表型极化，并抑制促肿瘤的M2表型。体内实验证实，肌苷治疗可显著减少CRLM小鼠模型的肝转移结节，下调促炎细胞因子TNF-α和IL-1β水平。深入的转录组学和分子机制研究发现，肌苷通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活，并调控CYP26A1、CYP39A1、BCL-2、PTGS2、OLFM1等关键基因的表达，从而发挥其抗转移效应。这项研究为肌苷作为一种潜在的新型免疫调节剂用于结直肠癌肝转移的治疗提供了重要的实验依据。
引言
结直肠癌（CRC）是全球范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，其高死亡率与极高的转移潜能密切相关。肝脏是结直肠癌最常见的转移部位，结直肠癌肝转移（CRLM）是导致患者死亡的主要原因，目前治疗手段有限。肿瘤微环境（TME）在癌症进展中扮演着关键角色，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TME中含量最丰富的免疫细胞之一。TAMs通常呈现两种主要功能表型：具有促炎和抗肿瘤作用的M1样表型，以及具有抗炎和促肿瘤作用的M2样表型。因此，将TAMs从促肿瘤的M2表型重编程为抗肿瘤的M1表型，已成为一种有前景的免疫治疗策略。
肌苷（IS）是一种内源性嘌呤核苷，是人体能量代谢和核酸合成的关键中间体。既往研究表明肌苷具有改善肝功能、调节免疫反应、甚至增强抗肿瘤免疫的作用，但其对巨噬细胞极化和结直肠癌转移的具体影响尚不清楚。本研究旨在探讨肌苷对CRLM的抑制作用及其通过调节巨噬细胞极化影响结直肠癌转移的分子机制。
材料与方法
研究采用体外和体内相结合的方法。在体外实验中，使用小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7、小鼠结肠癌细胞系MC-38、CT-26以及人结肠癌细胞系HT-29等细胞。通过Transwell实验检测肌苷直接处理、或与经肌苷处理的巨噬细胞条件培养基共培养后，对结直肠癌细胞侵袭能力的影响。通过流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）分析巨噬细胞极化标志物和细胞因子表达。
在体内实验中，通过脾内注射MC-38细胞构建CRLM小鼠模型。小鼠被随机分为正常组、模型组、奥沙利铂（OXA）阳性药组以及低、中、高剂量肌苷治疗组。通过评估体重、器官指数、肝组织苏木精-伊红（HE）染色观察转移情况、检测血清细胞因子水平以及流式分析脾脏巨噬细胞表型，来评价肌苷的治疗效果。此外，对肝组织进行转录组测序，并通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）验证关键靶基因和信号通路。
结果
- 1.
肌苷抑制结直肠癌细胞活力与侵袭：直接给予肌苷对MC-38细胞的增殖无明显抑制作用，但在与M1极化巨噬细胞共培养的条件下，肌苷能进一步显著抑制MC-38细胞的活力。Transwell实验表明，肌苷能直接抑制MC-38、CT-26和HT-29癌细胞的侵袭能力，且这种抑制作用在与M1巨噬细胞条件培养基共培养时得到进一步增强，呈现剂量依赖性。值得注意的是，肌苷对正常结肠上皮细胞CCD-841和人肾小管上皮细胞HK-2的侵袭能力无显著影响，显示出对肿瘤细胞的选择性。
- 2.
肌苷改善CRLM小鼠模型病情：在CRLM小鼠模型中，肌苷治疗能显著抑制肝脏转移结节的形成，其效果与奥沙利铂相当。HE染色显示，肌苷治疗组肝组织中肿瘤细胞浸润显著减少。与模型组相比，肌苷治疗显著降低了肝脏指数和脾脏指数，并对肾脏、心脏和胸腺指数有一定的保护或恢复作用，提示肌苷可能通过增强免疫功能来治疗CRLM。
- 3.
肌苷调节炎症因子与巨噬细胞表型：模型组小鼠血清中促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）水平显著升高。肌苷治疗能剂量依赖性地降低这两种细胞因子的水平，高剂量时可恢复至接近正常水平。流式细胞术分析显示，与正常组相比，模型组脾脏中M2表型标志物CD206+细胞比例显著增加，而M1表型标志物CD86+细胞比例无显著变化。肌苷治疗则能显著增加CD86+细胞（M1）的比例，并剂量依赖性地降低CD206+细胞（M2）的比例，表明肌苷在体内也能促进巨噬细胞向M1表型极化。
- 4.
转录组学揭示关键基因与通路：对正常组、模型组和高剂量肌苷治疗组小鼠肝组织进行转录组测序和差异表达基因（DEGs）分析。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，PI3K/AKT信号通路是肌苷作用的关键富集通路之一。研究进一步筛选出5个与免疫和肿瘤发展相关的核心差异表达基因：细胞色素P450家族成员CYP26A1和CYP39A1，B细胞淋巴瘤-2（BCL-2），前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2，即COX-2）以及嗅介蛋白1（OLFM1）。
- 5.
分子机制验证：RT-qPCR验证结果显示，与模型组相比，肌苷治疗能显著上调CYP26A1的表达，并使CYP39A1表达呈上升趋势；同时显著下调OLFM1和PTGS2的表达，BCL-2表达也呈下降趋势。此外，肌苷治疗能恢复模型组中降低的PI3K mRNA水平，并显著抑制升高的AKT mRNA水平。Western blot结果进一步证实，肌苷能显著降低磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化AKT（p-AKT）的蛋白水平，表明肌苷抑制了PI3K/AKT信号通路的激活。
讨论
本研究系统阐明了肌苷抑制结直肠癌肝转移的双重机制：一方面直接抑制肿瘤细胞的侵袭能力；另一方面通过调控肿瘤微环境中的免疫细胞发挥作用。肌苷能促进巨噬细胞向抗肿瘤的M1表型极化，同时抑制促肿瘤的M2表型极化。M1巨噬细胞可分泌促炎因子如TNF-α和IL-1β，但在本研究的CRLM背景下，肌苷反而降低了这些因子的血清水平，这可能与肌苷整体上缓解了模型相关的过度炎症状态有关，其具体调节网络值得深入探究。
机制上，肌苷的作用与抑制PI3K/AKT信号通路密切相关。该通路是调控细胞生存、增殖和代谢的核心通路，其异常激活与多种癌症的进展和转移有关。研究证实肌苷能抑制该通路的活化。同时，肌苷调控了多个下游关键基因：上调CYP26A1和CYP39A1可能有助于维持视黄酸和胆固醇代谢稳态；下调BCL-2可削弱肿瘤细胞的抗凋亡能力；下调PTGS2（COX-2）可减少前列腺素等促炎介质的产生；下调OLFM1则可能抑制与细胞粘附和信号转导相关的肿瘤进展过程。这些基因变化共同构成了肌苷抗转移效应的分子基础。
结论
综上所述，肌苷可通过促进巨噬细胞向M1表型极化，并抑制PI3K/AKT信号通路的激活，从而有效抑制结直肠癌细胞的侵袭和肝转移。该研究不仅揭示了肌苷作为一种内源性物质在抗肿瘤免疫中的新功能，也为其作为潜在的免疫调节剂应用于结直肠癌肝转移的联合治疗提供了重要的临床前证据。未来研究可进一步探索肌苷与化疗药物或免疫检查点抑制剂联用的协同效应。
