《Apoptosis》：Looking at the fraction with Annexin V? and propidium iodide?: insights into cell death types from preclinical studies in solid and haematological cancers
编辑推荐：
本综述深入探讨了在抗癌研究中广泛使用的Annexin V（Annexin V）与碘化丙啶（PI）双染色流式细胞术，揭示了Annexin V+/PI+细胞群不仅代表晚期凋亡，还可能是程序性坏死（Necroptosis）、细胞焦亡（Pyroptosis）、铁死亡（Ferroptosis）和铜死亡（Cuproptosis）等多种调节性细胞死亡的共同表征。文章通过梳理大量临床前研究，强调了建立标准化解读标准对增强研究间可比性和转化价值的重要性。
在癌症研究的广袤战场上，精准识别癌细胞如何“赴死”是评估疗效和理解耐药机制的关键。异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V与碘化丙啶（PI）共染色的流式细胞术，长久以来是量化凋亡和坏死细胞的“金标准”。该技术将细胞划分为四个象限：Annexin V-/PI-（活细胞）、Annexin V+/PI-（早期凋亡）、Annexin V+/PI+（通常被认为是晚期凋亡或坏死）以及Annexin V-/PI+（原发性坏死）。然而，越来越多的证据表明，这个看似明确的“晚期凋亡/坏死”象限（Annexin V+/PI+）可能是一个充满复杂性的“灰区”，它像一个混合体，不仅包含走向生命终点的凋亡细胞，还可能涵盖了多种“程序性”的细胞死亡形式。
流式细胞术与Annexin V/PI检测概述
流式细胞术是一种基于激光的快速、可靠技术，通过测量细胞的前向散射（FSC，反映细胞大小和折射率）和侧向散射（SSC，反映细胞内部复杂度）以及荧光信号来表征细胞。凋亡细胞常表现出FSC降低和SSC增加的特征。Annexin V能特异性结合外翻到细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸，这是早期凋亡的标志事件；而PI是一种DNA嵌入染料，无法透过完整的细胞膜，因此PI阳性表明细胞膜完整性已丧失。传统解读认为，Annexin V+/PI+的细胞处于凋亡晚期，其细胞膜已破损。
Annexin V+/PI+群体现身多种细胞死亡舞台
这篇综述汇总了来自13种不同癌症类型（包括22种人源和5种鼠源细胞系）的临床前研究，发现Annexin V+/PI+这一表现背后，隐藏着多元化的细胞死亡剧本：
- •
凋亡：这仍然是相关研究中最常报告的死亡方式。例如，在淋巴瘤、胶质母细胞瘤、三阴性乳腺癌等多种癌细胞中，药物处理导致Annexin V+/PI+比例升高，并伴随着半胱天冬酶激活、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白/BCL2凋亡调节剂比例改变、DNA断裂等经典凋亡特征。
- •
程序性坏死：这是一种受调控的坏死性死亡，不依赖于半胱天冬酶，而由受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶1/3和混合系列激酶样结构域介导。在肝细胞癌、结直肠癌等模型中，诱导Annexin V+/PI+增加的死亡可被Necrostatin-1所抑制，并伴有受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3和混合系列激酶样结构域磷酸化上调。
- •
细胞焦亡：这是一种由炎性小体激活、Gasdermin D蛋白介导的炎性程序性死亡。在乳腺癌细胞中，温和电刺激诱导的Annexin V+/PI+增加与焦亡相关基因表达升高相关。半胱天冬酶抑制剂（如z-VAD-FMK）可以抑制某些药物在胶质母细胞瘤细胞中诱导的凋亡和焦亡，同时也减少了Annexin V+/PI+细胞。
- •
铁死亡：这是一种铁依赖性的、由脂质过氧化物积累导致的调节性细胞死亡。在某些情况下，与铁死亡相关的Annexin V+/PI+细胞增加，伴随着谷胱甘肽耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4活性降低、活性氧水平升高和脂质过氧化。
- •
铜死亡：这是一种新近发现的、由过量铜触发、导致脂酰化线粒体酶聚集和铁硫簇蛋白丢失的细胞死亡。研究显示，在肺癌细胞中，铜离子载体诱导的细胞死亡伴随Annexin V+/PI+信号，且这一过程依赖于线粒体呼吸和蛋白质脂酰化。
此外，免疫原性细胞死亡虽然不是一种独立的死亡模式，但它可以发生在上述多种调节性细胞死亡过程中。其特征是释放损伤相关分子模式，如钙网蛋白、三磷酸腺苷、高迁移率族蛋白B1等，从而激活免疫应答。有研究表明，内质网应激和线粒体凋亡的协同作用可放大抗肿瘤免疫反应，导致大量损伤相关分子模式的释放。
讨论与展望：超越简单二分法
这些发现强烈提示，单纯依据Annexin V/PI流式结果将双阳性细胞一概归类为“晚期凋亡”是过度简化的，甚至可能是误导性的。该群细胞更恰当的归类或许是“晚期细胞死亡”。因为细胞死亡是一个复杂的生物学过程，不同死亡通路间存在交叉对话和相互影响。例如，凋亡抑制可能将细胞死亡转向程序性坏死；铁死亡诱导剂处理可能同时激活部分凋亡通路；而程序性坏死抑制剂Necrostatin-1在某些模型中也能抑制凋亡。
研究还指出，磷脂酰丝氨酸外翻并非凋亡的专属事件，也并非在所有凋亡细胞中都会发生。在某些细胞类型或特定刺激下，凋亡细胞可能不暴露磷脂酰丝氨酸。反之，在原发性坏死早期，也可能观察到磷脂酰丝 serine外翻。此外，常用的PI染料因其发射光谱较宽，可能与异硫氰酸荧光素或藻红蛋白的荧光发生串扰，使用7-氨基放线菌素D等染料或许能提供更好的分辨效果。
结论：迈向精准的细胞死亡解读
综上所述，Annexin V/PI双染法作为一种简便、定量的初筛工具，在评估抗癌药物或疗法诱导细胞死亡的总体效应方面具有重要价值。然而，要精确解析细胞死亡的具体模式，必须结合多种分子和形态学证据，如特定蛋白的激活状态（如切割的半胱天冬酶-3、磷酸化的混合系列激酶样结构域）、关键基因的表达变化、电镜下的超微结构观察，以及使用特异性的药理抑制剂或基因敲除/敲低进行功能验证。未来，开发能同时检测多种死亡通路的整合性分析平台，并深入理解不同死亡方式在肿瘤免疫微环境塑造和治疗抗性产生中的作用，对于推动抗癌研究的转化和实现精准肿瘤治疗至关重要。建立对Annexin V+/PI+细胞群的标准化解读共识，是提升研究可比性、可重复性和临床相关性的关键一步。
