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本文为解决石墨烯量子点（GQDs）在生物医学应用中的安全性问题，研究人员采用三维（3D）HepG2细胞球模型，系统评估了蓝光（B-GQDs）与绿光（G-GQDs）两种GQDs的细胞毒性与遗传毒性。研究发现，GQDs虽在特定浓度下显示细胞毒性且诱导DNA单链断裂（SSBs），但未引起DNA双链断裂（DSBs）或染色体数目异常，这为GQDs的潜在生物风险提供了更精细的评估，支持其在特定条件下的应用安全性。
纳米材料的迅猛发展拓宽了其在生物医学领域的应用前景，石墨烯量子点（Graphene Quantum Dots, GQDs）凭借其优异的荧光性能、生物相容性和易于功能化等特点，已成为药物递送、生物成像等领域的新星。然而，随着应用的深入，其潜在的生物安全性问题也日益受到关注。特别是在实际应用中，这些微小的纳米颗粒如何与复杂的生物系统相互作用？它们是否会对人体细胞，尤其是承担重要代谢功能的肝细胞造成伤害？这些问题尚未有明确的答案。目前，大多数毒性研究仍依赖于传统的二维（2D）细胞培养模型，这种模型虽然操作简便，但难以模拟体内细胞真实的三维（3D）微环境及细胞间相互作用，可能导致毒性评估结果与实际情况存在偏差。因此，建立一个更贴近生理状态的模型来准确评估GQDs的毒性，对于推动其安全应用至关重要。
为解答上述问题，一篇发表在《Archives of Toxicology》上的研究，采用了一种更先进的体外模型——三维（3D）HepG2肝细胞球（spheroid），对两种市面上常见的、发射光颜色不同（蓝色与绿色）的石墨烯量子点进行了全面的毒理学评估。该研究不仅关注了细胞活力，更深入到遗传物质层面，系统地探究了这些纳米材料是否会对DNA造成损伤。这为评估GQDs的生物安全性提供了更为坚实和贴近生理的数据基础。
为开展此项研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：首先，利用透射电子显微镜（TEM）、zeta电位和流体动力学半径测量对两种GQDs的物理化学性质（形貌、尺寸、聚集行为和胶体稳定性）进行表征。其次，采用三维（3D）HepG2肝细胞球作为体外模型，通过强制悬浮法培养形成细胞球体。在毒理学评估方面，利用CellTiter-Glo发光法测定细胞活力（ATP检测），以评估细胞毒性；采用彗星实验（comet assay）检测DNA单链断裂等初级DNA损伤；并通过流式细胞术分析γH2AX（DNA双链断裂标志物）和磷酸化组蛋白H3（p-H3，细胞有丝分裂标志物及染色体数目异常标志物）的表达水平，以评估其潜在的致染色体断裂（clastogenic）和致非整倍体（aneugenic）活性。
结构及物理化学性质
研究人员首先对蓝光（B-GQDs）和绿光（G-GQDs）发射的石墨烯量子点进行了表征。透射电镜（TEM）图像显示，B-GQDs形状更不规则且易聚集，而G-GQDs则更趋向球形或椭圆形，分散更均匀。zeta电位和流体动力学半径的测量进一步揭示，在纯水中，G-GQDs显示出更高的负zeta电位（-51.6 mV）和更小的流体动力学半径（1209.4 nm），表明其胶体稳定性优于B-GQDs。在细胞培养基中，两者zeta电位绝对值均显著下降，流体动力学半径也大幅减小，这被认为是培养基中离子屏蔽和蛋白质在量子点表面形成“蛋白质冠”（protein corona）所致。这些物理化学性质的差异可能影响它们在生物环境中的行为和潜在的生物效应。
B-GQDs与G-GQDs的毒理学表征
在三维HepG2细胞球模型中，研究人员评估了GQDs的细胞毒性。结果表明，两种GQDs均在高浓度下表现出剂量依赖性的细胞毒性。具体而言，B-GQDs仅在最高浓度250 μg/mL（对应100 μg/cm2）下使细胞活力降至约75%；而G-GQDs的毒性更强，在100 μg/mL和250 μg/mL时均显著降低了细胞活力，在250 μg/mL时降至约50%。
在非细胞毒性浓度（12.5-100 μg/mL）下，研究人员进一步评估了遗传毒性。彗星实验结果显示，两种GQDs在浓度≥25 μg/mL时，均能引起DNA损伤的剂量依赖性显著增加，表现为彗星尾DNA百分比上升，这主要指示DNA单链断裂（SSBs）等初级DNA损伤。然而，通过流式细胞术检测DNA双链断裂（DSBs）的标志物γH2AX，以及指示染色体分离异常（aneugenic）的标志物磷酸化组蛋白H3（p-H3），均未发现任何浓度的GQDs能引起这两种蛋白表达水平的显著变化。这意味着，在所测试的条件下，这两种GQDs没有表现出导致染色体结构断裂（clastogenic）或染色体数目异常（aneugenic）的活性。
结论与讨论
综合所有结果，这项研究得出明确结论：在本研究采用的实验条件和非细胞毒性浓度范围内，无论是蓝光还是绿光发射的石墨烯量子点，均未在三维HepG2细胞球模型中诱导出DNA双链断裂（DSBs，以γH2AX为标志）或染色体分离异常（以p-H3为标志）。然而，两者均能诱导剂量依赖性的DNA单链断裂（SSBs），表明存在亚致死水平的遗传毒性压力。这种初级DNA损伤很可能与氧化应激、DNA修复途径受损或复制压力有关，其具体机制有待未来研究阐明。
这项研究的意义在于，它利用更接近体内生理环境的三维细胞模型，对GQDs的毒性进行了多层面、多终点的精细评估。研究结果将GQDs的潜在遗传毒性风险具体化：它们主要引起的是可被修复的DNA单链损伤，而非更危险的染色体结构或数目畸变。这为理解GQDs与生物系统相互作用的复杂性提供了新的见解，特别是指出了物理化学性质（如荧光颜色、聚集状态）可能影响其生物学效应。从安全评估和监管角度看，这些发现强调了将初级DNA损伤（如通过彗星实验检测）纳入石墨烯基纳米材料危害识别和风险评估框架的重要性，尤其是在职业暴露或生物医学应用场景中。尽管在测试条件下未观察到严重的染色体损伤，但DNA单链断裂的存在提示我们，在推动GQDs广泛应用的同时，仍需持续关注其长期或慢性暴露可能带来的潜在风险。未来的研究应侧重于深入探索GQDs诱导DNA损伤的分子机制（如氧化应激反应、DNA修复动力学），并结合更长期的暴露研究和更广泛的基因组不稳定性检测（如微核试验），以全面评估其安全性，从而为石墨烯量子点的安全设计、优化和最终的安全应用奠定坚实的科学基础。
