苹果免疫新机制：受体激酶MdRLKT1通过磷酸化MdRAX2转录抑制MdMKS1以增强对苹果腐烂病菌（Cytospora mali）的抗性

《Plant Biotechnology Journal》：MdRLKT1–MdRAX2–MdMKS1 Module Positively Regulating Resistance to Cytospora mali in Apple

本文揭示了一个在苹果抗性中发挥关键作用的新信号模块。研究发现，受体样激酶MdRLKT1通过磷酸化MYB转录因子MdRAX2的丝氨酸147位点，增强其转录抑制功能，从而下调负调控因子MdMKS1的表达，最终正调控苹果对腐烂病菌（C. mali）的抗性。该工作阐明了植物如何通过磷酸化级联精确调控免疫应答的新机制，为果树抗病育种提供了新靶点。

　　

2.1 受体样激酶MdRLKT1在苹果响应苹果腐烂病菌（Cytospora mali）中发挥积极作用

为了探究MdRLKT1在抗病中的功能，研究创建了两个稳定的转基因苹果品系Ri1和Ri2，这两个品系中MdRLKT1的表达被抑制。定量PCR分析显示，与野生型相比，RNA干扰（RNAi）系中MdRLKT1的相对表达水平显著降低。重要的是，沉默MdRLKT1显著降低了苹果叶片对C. mali的抗性。随后，检测了苹果叶片中活性氧（ROS）和胼胝质的积累，结果显示，在Ri植株中，两者的水平均低于对照。此外，沉默MdRLKT1显著降低了苹果防御相关基因MdPR1、MdPR2、MdPR4、MdPR5以及ROS产生相关基因MdRBOHD的转录水平。这些结果表明，MdRLKT1通过激活宿主防御反应，在宿主对C. mali的抗性中发挥积极作用。

2.2 MdRLKT1与MdRAX2相互作用

为了阐明MdRLKT1在植物免疫中的作用，研究利用酵母双杂交（Y2H）系统，以MdRLKT1的编码序列为诱饵筛选苹果cDNA文库，结果鉴定出包括转录因子MdRAX2在内的相互作用蛋白。酵母双杂交、免疫共沉淀、荧光素酶互补成像以及双分子荧光互补等实验均证实MdRLKT1的胞内结构域与MdRAX2在植物体内存在相互作用。进一步的亚细胞定位分析显示，MdRAX2-GFP融合蛋白同时定位于细胞核和质膜。当与对照mCherry共表达时，MdRAX2-GFP分布在细胞质和细胞核中；然而，当与MdRLKT1-mCherry共表达时，MdRAX2-GFP信号在细胞核中显著积累。这种重新分布表明，与MdRLKT1的相互作用促进了MdRAX2的核输入。

2.3 MdRAX2正调控苹果对苹果腐烂病菌（Cytospora mali）的抗性

瞬时表达实验表明，在苹果叶片中瞬时过表达MdRAX2可增强对C. mali的抗性，与空载体对照相比，病斑面积减少了10.6%。此外，过表达MdRAX2的苹果叶片在接种C. mali后显示出增强的ROS积累和胼胝质沉积。相反，在MdRAX2-RNAi苹果叶片中，病斑面积比空载体处理叶片大41.8%，且瞬时沉默MdRAX2减少了ROS积累和胼胝质沉积。这些结果表明MdRAX2正调控苹果对C. mali的抗性。进一步的遗传互作实验显示，在过表达MdRLKT1的背景下，同时沉默MdRAX2会完全消除由MdRLKT1过表达诱导的抗性表型，表明MdRAX2是MdRLKT1介导的抗性所必需的。

2.4 MdRLKT1在体外磷酸化MdRAX2的Ser-147位点

体外激酶实验证实了MdRLKT1与MdRAX2的直接相互作用。当GST-MdRLKT1^CD蛋白与GST-MdRAX2-His孵育时，观察到了对应于GST-MdRAX2-His蛋白分子量的清晰磷酸化条带。而使用激酶死亡突变体MdRLKT1^KM（MdRLKT1^D432A）或反应体系中不含ATP时，则未检测到磷酸化信号，表明MdRLKT1的激酶活性是磷酸化MdRAX2所必需的。经λ-磷酸酶处理后，GST-MdRAX2-His的磷酸化条带消失，证实MdRLKT1在体外磷酸化MdRAX2。通过液相色谱-串联质谱分析和体外激酶实验，确定丝氨酸147是MdRLKT1磷酸化MdRAX2的关键位点。在苹果叶片中过表达MdRAX2可显著增强对C. mali的抗性，而过表达磷酸化位点失活的突变体MdRAX2^S147A则导致病斑面积与表达空载体GFP的叶片相似。这些结果说明，MdRLKT1在Ser-147位点对MdRAX2的磷酸化增强了苹果叶片对C. mali的抗性。序列比对分析显示，MdRAX2的Ser147位点在多种物种中高度保守。

2.5 MdRAX2结合MdMKS1启动子并抑制其表达

由于MdRAX2具有转录激活活性，它可能通过调控靶基因表达在免疫应答中发挥作用。研究通过DNA亲和纯化测序在全基因组范围内鉴定MdRAX2的结合位点，结果显示MdRAX2结合位点有14.35%位于启动子区。基因本体富集分析表明，大部分靶基因定位于细胞核。在鉴定的候选基因中，MAP激酶底物1（MKS1）被选中进行进一步分析。值得注意的是，MdRAX2对富含AG的基序表现出最高的结合亲和力，而MdMKS1的启动子含有此类AG富集序列。电泳迁移率变动分析和酵母单杂交实验均证实，MdRAX2直接结合MdMKS1启动子，而将Ser147突变为丙氨酸（S147A）并不影响MdRAX2与MdMKS1启动子的结合能力。荧光素酶报告基因和β-葡萄糖醛酸酶活性检测均表明，MdRAX2可转录抑制MdMKS1的启动子活性，而突变体MdRAX2^S147A则丧失了这种转录抑制能力。电泳迁移率变动分析还显示，在ATP存在下，经MdRLKT1孵育后，GST-MdRAX2对MdMKS1启动子的DNA结合亲和力增强，而GST-MdRAX2^S147A的结合能力则无明显变化。这些结果表明，MdRAX2转录抑制MdMKS1的表达，且MdRAX2在Ser147位点的磷酸化对其转录调控活性至关重要。

2.6 MdMKS1负调控苹果对苹果腐烂病菌（Cytospora mali）的抗性

研究发现，在苹果叶片中瞬时过表达MdMKS1会显著降低对C. mali的抗性，而瞬时沉默MdMKS1则显著增强抗性。此外，过表达MdMKS1显著增加了防御相关基因MdPR1、MdPR2、MdPR4和MdPR5的转录水平，而沉默MdMKS1则导致MdPR2、MdPR4和MdPR5的表达显著上调。这些结果表明，MdMKS1可能通过抑制病程相关（PR）基因的表达来负调控宿主对C. mali的抗性。

讨论：一个调控苹果抗性的新信号模块

本研究定义了一个新的MdRLKT1–MdRAX2–MdMKS1调控模块，该模块在苹果对C. mali的抗性中发挥关键作用。受体样激酶MdRLKT1通过在一个保守的丝氨酸残基（Ser147）上磷酸化转录因子MdRAX2来正调控苹果免疫应答。这种磷酸化激活了MdRAX2对MdMKS1（一个抗病性的负调控因子）的转录抑制。本研究不仅阐明了一种由苹果受体样激酶介导的新信号机制，也为长期改良果树的抗病性提供了重要的理论基础。

3.1 MdRLKT1是苹果树免疫应答中的关键正调控因子

本研究中，MdRLKT1-RNAi株系对C. mali感染的敏感性增强，表明MdRLKT1作为苹果防御的正调控因子发挥作用。这项研究揭示了MdRLKT1–MdRAX2信号模块，其中MdRLKT1直接磷酸化MYB转录因子MdRAX2，从而调控其亚细胞定位和转录抑制活性。这种受体激酶绕过细胞质激酶直接调控转录因子的机制表明，植物可能利用这种更直接的途径来实现对核内基因表达的快速精确控制以应对免疫。

3.2 磷酸化对MdRAX2的免疫调节功能至关重要

本研究发现，瞬时沉默MdRAX2会增加感病性，而过表达MdRAX2的植株表现出对C. mali增强的抗性。体外激酶实验确定丝氨酸147是特异的磷酸化位点。过表达去磷酸化模拟突变体MdRAX2^S147A的转基因植株对C. mali的抗性显著降低，明确证实Ser147位点的磷酸化对于MdRAX2完全激活其抗病功能是必需的。此外，本研究表明MdRLKT1不仅与转录因子MdRAX2相互作用，还显著促进其向细胞核的转运。这一结果表明，MdRLKT1可能通过磷酸化修饰主动调节MdRAX2的核质分布，从而增强其转录抑制活性。Ser147磷酸化的功能重要性还通过其异常的进化保守性得到凸显，序列比对显示该残基在多种植物物种中保持不变。

3.3 MdRAX2通过磷酸化依赖途径抑制MdMKS1的转录

本研究采用DNA亲和纯化测序在全基因组范围内筛选MdRAX2的结合位点，明确鉴定出MdMKS1的启动子区域是MdRAX2的直接结合靶点。实验验证证实，MdRAX2通过结合MdMKS1启动子发挥转录抑制因子功能，显著抑制MdMKS1基因表达。更重要的是，当MdRAX2的Ser147突变为丙氨酸时，其对MdMKS1的转录抑制活性完全丧失，直接证明该残基的磷酸化状态是MdRAX2转录调控功能的核心先决条件。随后的结合亲和力实验表明，MdRLKT1介导的MdRAX2磷酸化显著增强了其与MdMKS1启动子的结合亲和力。这些结果表明，MdRAX2的转录抑制功能依赖于MdRLKT1介导的磷酸化。本研究发现，在苹果叶片中瞬时过表达MdMKS1会降低对C. mali的抗性，而瞬时沉默MdMKS1则会增强抗性。此外，在MdMKS1过表达植株中，病程相关基因PR1、PR2、PR4和PR5的表达水平显著降低。这些数据确立了MdMKS1作为拟南芥MKS1的功能同源物，充当免疫应答的负调控因子。本研究通过鉴定MYB转录因子MdRAX2作为MdMKS1的关键上游转录调节因子，直接解决了MdMKS1表达本身的上游转录机制这一基本问题。这一发现揭示了这一关键的负向免疫调节因子的表达本身处于精确的转录控制之下，建立了一个新的调控层面，表明正向免疫信号MdRAX2可能通过抑制负向免疫组分MdMKS1的表达来微调植物的防御反应。

总而言之，本研究证明了MdRLKT1通过在丝氨酸147位点磷酸化MdRAX2，从而增强MdRAX2抑制免疫抑制基因MdMKS1转录的能力，最终赋予苹果对C. mali的抗性。这些发现揭示了一种RLK直接磷酸化转录因子，从而通过转录调控基因表达来调节苹果对C. mali抗性的机制。