《Plant Biotechnology Journal》：The Advantaged Salt Inducible Suaeda salsa SsNRT2.5 and Its Promoter Significantly Enhance Nitrate Transport Efficiency and Salt Tolerance in Transgenic Arabidopsis and Rice
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本研究深入探索了盐生植物碱蓬（Suaeda salsa）中的高亲和硝酸盐转运蛋白基因SsNRT2.5及其启动子。研究发现，该基因及其启动子模块能在盐胁迫和低硝酸盐（NO3–）条件下显著增强拟南芥和水稻的NO3–吸收、转运效率和耐盐性，为培育高氮效利用（NUE）耐盐作物提供了宝贵的遗传资源和理论支持。
1 引言
在可持续农业发展的背景下，土壤盐渍化和氮肥利用效率（NUE）低下是制约作物产量的两大关键挑战。高效的氮吸收对作物产量至关重要，而土壤盐渍化会抑制植物对氮的获取。硝酸盐（NO3–）是植物最主要的氮源之一，其吸收和转运主要由硝酸盐转运蛋白（NRT）家族介导。NRT2.5属于高亲和硝酸盐转运系统（HATS），在应对氮饥饿、参与硝酸盐转运、种子硝酸盐积累等方面发挥着多重功能。
耐盐盐生植物碱蓬（Suaeda salsa）是一种重要的盐碱地修复植物，其能在高盐和低氮生境中高效吸收并积累硝酸盐，暗示其可能存在独特的氮吸收机制。本研究假设，源自碱蓬的SsNRT2.5基因及其启动子的功能可能与非盐生植物（如拟南芥）中的同源基因存在差异。为了阐明其功能，本研究克隆了SsNRT2.5基因及其启动子，并将其转化至拟南芥和水稻中，旨在揭示其在盐胁迫和低硝酸盐条件下调控硝酸盐转运的分子与生理机制，为培育氮高效、耐盐作物提供基因资源和理论基础。
2 结果
2.1 SsNRT2.5基因及其启动子序列分析
从碱蓬根部克隆得到全长1653 bp的SsNRT2.5 cDNA序列，其开放阅读框（ORF）为1524 bp。系统发育分析表明，SsNRT2.5与甜菜、藜麦和菠菜中的同源蛋白亲缘关系最近。通过基因组步移技术获得了SsNRT2.5基因上游2774 bp的启动子序列。顺式作用元件分析显示，该启动子除了含有核心元件（TATA框和CAAT框）外，还富含大量与氮代谢、盐胁迫响应、植物激素调控及转录因子结合相关的元件，如氮相关的GATABOX、盐响应元件GT-1、干旱/高盐/低温响应元件DRE、脱落酸（ABA）响应元件ABRE等。相比之下，来自拟南芥的AtNRT2.5启动子（2193 bp）所含的盐响应和ABA调控元件数量较少，且氮相关的DE基序和多胁迫响应DRE元件为SsNRT2.5启动子所特有。
2.2 SsNRT2.5在根和种子中的相对表达水平
盐胁迫显著影响SsNRT2.5在碱蓬根中的表达模式。在300 mM NaCl处理下，其表达量随时间推移持续上调，并在处理7天后仍保持较高水平。在自然生境中，碱蓬黑色种子中的SsNRT2.5表达量显著高于棕色种子，且经200 mM NaCl处理的母株所产黑色种子的表达量更高，这与种子中观察到的硝酸盐积累趋势一致。
2.3 SsNRT2.5在本氏烟草中的亚细胞定位及其在拟南芥中的表达模式
亚细胞定位实验表明，融合了绿色荧光蛋白（GFP）的SsNRT2.5蛋白特异性定位于本氏烟草叶细胞的细胞质膜上，证实SsNRT2.5是一种质膜定位蛋白。通过构建pSsNRT2.5::GUS报告基因载体并转化拟南芥，GUS组织化学染色分析显示，SsNRT2.5在拟南芥的根、叶、花、果荚和种子中均有表达。
2.4 低氮条件下不同拟南芥株系的鲜重、根长和硝酸盐含量
构建了SsNRT2.5过表达拟南芥株系（OE15, OE35, OE54）和利用CRISPR/Cas9技术敲除AtNRT2.5的突变体株系（M2, M22）。在0-100 mM NaCl处理下，过表达株系的根长和鲜重均显著高于野生型（WT）。盐处理后，过表达株系根系和叶片中能维持较高的硝酸盐含量，同时积累了更少的Na+和更多的K+。在0 mM硝酸盐处理下，突变体M22的根长和鲜重显著低于WT。在低硝酸盐（0.5 mM）和200 mM NaCl胁迫下，过表达株系OE15的发芽率下降不明显，而WT和突变体的发芽率显著降低。过表达株系种子中的硝酸盐含量显著增加，而突变体M22种子中的含量降低。这些结果表明，SsNRT2.5能促进植物在盐胁迫下的硝酸盐吸收和积累，降低Na+毒害，并可能通过提高种子硝酸盐储存来增强种子活力与耐盐性。
2.5 由自身启动子驱动的SsNRT2.5对盐和低硝酸盐的响应
为了阐明SsNRT2.5启动子在盐胁迫下调控硝酸盐吸收的作用，构建了pSsNRT2.5::SsNRT2.5-sGFP载体并获得转基因拟南芥株系（SsP6, SsP7, SsP11）。在低硝酸盐固体培养基上，无盐胁迫时，转基因株系与WT鲜重无显著差异；但在50 mM NaCl处理下，转基因株系的鲜重、根长以及根和叶片中的硝酸盐含量均显著高于WT。在营养土中，100和150 mM NaCl处理显著增加了这些转基因株系在营养生长和生殖生长阶段的生物量、叶片及种子中的硝酸盐含量，同时降低了叶片Na+和丙二醛（MDA）含量，并提高了AtHKT1的表达。这表明SsNRT2.5启动子能驱动该基因在盐胁迫下特异性高表达，从而增强植物的硝酸盐吸收和耐盐性。
2.6 SsNRT2.5与AtNRT2.5响应盐胁迫的比较分析
在低硝酸盐条件下，过表达SsNRT2.5或AtNRT2.5的拟南芥株系在盐胁迫下根长均长于WT，其中过表达SsNRT2.5的株系（SsOE15, SsOE35）表现最优，在150 mM NaCl下优势更明显。在幼苗水培实验中，50和100 mM NaCl处理下，各过表达株系的生物量均显著高于WT，叶片Na+含量显著降低，其中SsOE15和SsOE35的生长最旺盛，叶片Na+含量最低，叶片硝酸盐含量也显著高于过表达AtNRT2.5的株系。这表明SsNRT2.5在促进硝酸盐吸收和增强耐盐性方面功能优于AtNRT2.5。
2.7 由自身启动子驱动的SsNRT2.5与AtNRT2.5响应盐胁迫的比较分析
在低氮条件下，对携带pAtNRT2.5::AtNRT2.5-sGFP和pSsNRT2.5::SsNRT2.5-sGFP的转基因拟南芥株系进行功能比较。在100 mM NaCl处理下，所有转基因株系根长均增加，其中SsP6、SsP7和SsP11株系的增加最为显著。在幼苗期，盐胁迫下转基因株系的株高、鲜重和干重、叶片硝酸盐、K+和叶绿素含量均显著增加，而叶片Na+含量和相对电导率降低，其中SsNRT2.5转基因株系的变化幅度大于AtNRT2.5转基因株系。在100 mM NaCl处理下，转基因株系中NRT2.5的表达量显著高于WT，尤其在SsP6、SsP7和SsP11株系中增幅最大。GUS染色结果显示，在100 mM NaCl处理下，携带ProSsNRT2.5的转基因拟南芥和本氏烟草叶片染色程度均深于携带ProAtNRT2.5的株系，且盐处理加深了染色。这些结果证明，转入了SsNRT2.5基因及其启动子的拟南芥株系，其耐盐性显著强于转入AtNRT2.5基因及其启动子的株系。
2.8 5'端缺失对SsNRT2.5启动子活性的影响
通过5'端缺失方法剖析启动子功能。瞬时转化实验显示，在碱蓬和本氏烟草中，Q1和Q2片段驱动的GUS染色在100 mM NaCl处理下增强，而Q3片段驱动的活性减弱。在转基因拟南芥中得到了一致的结果，即盐胁迫增强了Q1和Q2片段的GUS染色强度。这表明SsNRT2.5启动子是一个盐诱导型启动子，Q1和Q2片段中含有的盐相关顺式作用元件使得该启动子能在盐胁迫下驱动基因表达上调。
2.9 由自身启动子驱动的SsNRT2.5在水稻中对盐胁迫和低硝酸盐的响应
将pSsNRT2.5::SsNRT2.5-GFP表达载体导入水稻。在0 mM NaCl时，转基因水稻株系（L1, L2, L4）与WT在表型和参数上无显著差异。但在50和100 mM NaCl处理下，转基因株系的发芽率、鲜重、根长、生物量、叶片叶绿素a+b和硝酸盐含量均显著高于WT，而叶片Na+含量显著降低，K+含量增加。同时，转基因株系根系中盐胁迫响应基因OsHKT1和OsSOS1的表达上调。在100 mM NaCl处理下，转基因株系的单株种子产量和种子硝酸盐含量也显著高于WT，且种子中SsNRT2.5的表达水平更高。这表明SsNRT2.5不仅能促进根系硝酸盐吸收，还能介导向种子的硝酸盐转运和储存，从而增强水稻的耐盐性。
3 讨论
盐胁迫通过诱导离子毒害、渗透胁迫和营养失衡对植物生长产生不利影响。硝酸盐作为主要氮源，在植物耐盐性中起着关键作用。先前研究表明碱蓬在盐渍条件下具有高效的硝酸盐吸收能力。本研究证实，SsNRT2.5在低硝酸盐条件下受盐胁迫持续上调表达，与AtNRT2.5的表达模式不同。SsNRT2.5过表达能促进盐渍条件下硝酸盐的吸收和转运，其蛋白定位于质膜，在根、叶、花、果荚和种子中均有表达，并参与调控种子硝酸盐积累，这可能有助于提高种子活力以适应盐渍环境。
启动子及其顺式作用元件精确调控基因表达。SsNRT2.5启动子含有丰富的盐胁迫响应和氮响应元件，使其具备盐诱导特性。启动子5'端缺失分析证实，其活性与这些顺式元件的存在密切相关。与AtNRT2.5启动子相比，SsNRT2.5启动子含有更多盐响应和胁迫响应转录因子结合元件，表明其在盐胁迫下调控硝酸盐吸收的作用更为突出。
比较研究表明，无论是基因本身还是“基因+启动子”模块，SsNRT2.5在提升转基因拟南芥和水稻的硝酸盐积累、生物量及耐盐性方面均优于AtNRT2.5。在水稻中，转基因SsNRT2.5显著提高了盐胁迫下的发芽率、生长指标、产量和种子硝酸盐含量。
硝酸盐在盐生植物中兼具营养和渗透调节作用。转基因植株能维持较低Na+含量的原因可能是：(1) 更高的硝酸盐吸收促进了生物量增长，稀释了Na+浓度；(2) 硝酸盐作为信号分子上调了HKT1等离子的表达，增强了根系排Na+能力。协同其自身的渗透调节功能，共同增强了植物的耐盐性。
总之，SsNRT2.5及其启动子能显著增强作物在盐渍和低氮条件下的硝酸盐吸收效率，这为通过遗传工程手段培育氮高效利用且耐盐的作物品种提供了可行的策略，有助于在减少氮肥投入的同时保障粮食生产，对发展可持续盐碱地农业具有重要意义。
4 材料与方法
研究材料为来自黄河三角洲内陆盐渍土的碱蓬棕色种子幼苗、拟南芥哥伦比亚生态型（Col-0）和水稻品种日本晴。通过水培和固体培养基培养，设置不同的硝酸盐浓度和NaCl浓度处理。采用RT-qPCR分析基因表达，通过同源克隆和基因组步移技术克隆基因及启动子序列。利用农杆菌介导法进行拟南芥、水稻的稳定转化以及本氏烟草、碱蓬的瞬时转化。通过GUS组织化学染色分析启动子活性。采用试剂盒法测定硝酸盐含量，火焰光度法测定Na+、K+含量。数据使用SAS和SPSS软件进行统计分析。
