《Plant Biotechnology Journal》：Metabolic Enzyme MeHNL11 Regulates MeCAS1b Transcription for Cyanide Reutilization in Response to Nitrate Deficiency in Cassava
编辑推荐：
这项研究首次发现木薯的羟基腈裂解酶MeHNL11是一种双功能蛋白，它不仅具有代谢酶活性，还能在氮缺乏胁迫下入核，行使转录因子功能。MeHNL11通过其羟基腈裂解酶活性分解氰苷(CGs)产生氰化物，并利用其独特的Cys245位点形成寡聚体。在氰化物入核后，寡聚体解离为单体，从而戏剧性地上调氰丙氨酸合成酶基因MeCAS1b的转录。这一机制帮助木薯维持细胞内氰化物稳态，并将氰化物转化为初级氮代谢产物(NH4+、游离氨基酸等)，从而缓解氮缺乏胁迫。该研究揭示了MeHNL11-MeCAS1b模块在氮素再利用中的关键作用，为解析木薯高效适应低氮土壤的分子机制提供了新见解。
1 Introduction
木薯(Manihot esculenta Crantz)是全球第六大粮食作物，其显著特点是能适应贫瘠的土壤。木薯的表观氮利用效率高达50%–70%，远超传统禾谷类作物，但其耐受低氮的分子机制尚未被充分解析。氮利用效率(NUE)是一个复杂的农艺性状，受氮吸收、同化和再分配三个内部过程影响。植物在氮缺乏时，可以通过促进根部吸收或再利用组织内储存的氮库来满足生长需求。植物次生代谢物被证明在养分循环中发挥作用，例如拟南芥中的硫代葡萄糖苷能被催化并重新整合进入初级硫代谢。然而，含氮次生代谢物是否能在氮受限条件下参与氮的再利用，目前尚不清楚。
氰苷(CGs)是植物防御化合物，在多种氰化物植物科中广泛分布。以高CG含量闻名的木薯，主要含有两种脂肪族单糖苷：亚麻苦苷(95%)和百脉根苷(5%)。氰苷的合成途径在木薯中已被阐明，其限速步骤涉及缬氨酸和异亮氨酸在细胞色素P450单加氧酶CYP79D1/D2催化下转化为乙醛肟。氰苷通常被隔离在液泡中，与其分解酶物理分离。但当动物取食木薯时，细胞壁β-葡萄糖苷酶和羟基腈裂解酶依次作用，将氰苷分解为丙酮和剧毒物质氢氰酸。植物进化出通过氰丙氨酸途径同化HCN的机制，即HCN和半胱氨酸在氰丙氨酸合成酶作用下转化为硫化氢(H2S)和氰丙氨酸。氰丙氨酸随后在腈水解酶作用下，代谢为天冬酰胺/天冬氨酸和铵。这一过程缓解了氢氰酸的毒性，并将其整合到含氮的初级代谢物中。氰丙氨酸合成酶除了在HCN解毒中起关键作用外，还通过维持植物体内HCN和H2S的平衡，调节植物的生长、发育和胁迫适应。
羟基腈裂解酶在包括拟南芥、木薯、杏仁、亚麻和橡胶树在内的多种植物中被鉴定。作为生物催化剂，HNL可逆地催化HCN与醛或酮形成具有光学活性的氰醇。在氮缺乏条件下，氰化物可以作为植物的替代氮源。当铵和氰化物同时施用于小麦和高粱时，NH4+供应的减少显著增强了氰化物的转运和同化，支持正常植物生长。此外，在缺氮环境中，外源施用氰化物刺激了氰丙氨酸合成酶和天冬酰胺酶等关键酶的活性，与未处理的植物相比，植物生长得到改善。这些证据表明，植物在氮缺乏时期可以吸收外源氰化物。
2.1 MeCAS1bWas Significantly Upregulated in Fibrous Roots Under Low N Conditions
对木薯SC8植株的根系进行RNA-seq分析，比较了氮缺乏(0 mM)和正常氮水平(5 mM NO3-或5 mM NH4+)处理2小时后的差异。鉴定出1279个差异表达基因。KEGG富集分析显示，这些差异表达基因主要涉及碳代谢、氮代谢和谷氨酰胺代谢。值得注意的是，氰化氨基酸代谢途径高度富集，该途径涵盖了氰苷的合成与降解以及氰化物的同化。具体而言，在氰苷合成中起关键作用的基因MeCYP79D2显著下调。相反，负责分解氰苷的MeHNL11及其下游参与氰化物同化的MeCAS1b在低氮条件下均显著上调。RT-qPCR分析验证了MeCAS1b在低氮条件下的叶片和根中均显著上调。有趣的是，该基因在低氮条件下的根中表现出最高的转录活性，而在正常氮条件下主要在叶片中表达。经过0.1 mM NO3-缺氮处理8天后，MeCAS1b在根中的表达水平增加最为显著。在cyp79d1/d2突变体和外源施用氰化物解毒剂羟钴胺(COB)的植株中进行进一步处理，结果表明，在缺氮处理下，MeCAS1b的转录水平增加了47.5倍，而额外施用COB后仅增加了22.6倍。在氰苷缺陷突变体cyp79d1/d2中，MeCAS1b的表达水平没有显著变化，仅增加了3.4倍。这些结果进一步支持了低氮诱导MeCAS1b上调，且这种上调与体内HCN浓度呈正相关。
2.2 The Block of Cyanide From the Degradation of CG Can Further Exacerbate N Deficiency Symptoms in Cassava
为了进一步研究氰苷对木薯低氮适应的贡献，在低氮和正常氮条件下施用已知的氰化物解毒剂羟钴胺(COB)，以阻断MeCAS1b对氰化物的同化。在低氮条件下，外源施用COB的植株表现出更典型的氮缺乏症状，包括更严重的叶片黄化、更细长的根、更低的叶绿素含量、更高的花青素积累和更低的生物量。此外，LNC和NNC的总氮含量分别显著低于LN和NN。LNC和LN中的氰苷含量分别显著低于NNC和NN。LNC中的NH4+和游离氨基酸含量显著低于LN，且主要分布在根中。这些发现表明，氰化物浓度的降低减少了氰化物被循环利用的可能性，导致植物出现更明显的氮缺乏症状。同时，总氮含量以及易于流动的氮形态（如铵离子和游离氨基酸）水平下降，生物量减少。总之，木薯通过促进氰苷分解并将氰化物转化为NH4+和氨基酸来促进氮的再利用，增强对低氮条件的适应。
2.3 Isolation and Bioinformatic Analysis of MeHNL11 in Cassava
研究者利用MeCAS1b的860 bp启动子作为诱饵，筛选经过低氮处理的木薯根cDNA文库。经过严格的复检和PCR鉴定，通过Sanger测序和功能注释鉴定出20个候选互作蛋白。在这些候选蛋白中，MeHNL11的出现频率最高，达8次。羟基腈裂解酶负责通过分解氰醇来释放氰化物，其下游的MeCAS1b可以将氰化物同化为β-氰丙氨酸。这种相互作用暗示了MeHNL11和MeCAS1b在氮胁迫条件下的氰苷代谢途径中可能存在调节联系。
在木薯的11个HNL家族成员中，MeHNL11与拟南芥和橡胶树HNL的氨基酸序列具有高度同源性。它包含一个位于121-165位氨基酸的保守肽底物识别和结合位点，以及由第82位的丝氨酸、第208位的天冬氨酸和第236位的组氨酸定义的三个催化活性位点。换言之，HNL的结构域暗示MeHNL11是具有催化活性的典型羟基腈裂解酶。根据木薯11个组织特异性转录组分析，MeHNL11在根中特异性表达。同时，RT-qPCR分析表明，该基因在低氮条件下显著上调。
2.4 MeHNL11 Shuttled Into the Nucleus From Cytoplasm Under Low N Treatment
在木薯叶肉原生质体中瞬时表达由35S启动子驱动的MeHNL11-GFP融合蛋白。为了量化蛋白质在细胞质和细胞核之间的分布，使用ImageJ软件计算平均荧光强度比值，以DAPI为参照。在原生质体中，经0.5 mM NO3-处理后，绿色荧光强度和MFI比值与10 mM NO3-处理相比显著增加。然而，当额外施用COB时，0.5 mM NO3-和10 mM NO3-处理之间的绿色荧光强度和MFI比值没有显著差异。同样，在cyp79d1/d2突变体中，0.5 mM NO3-和10 mM NO3-处理之间也没有观察到绿色荧光强度和MFI比值的显著变化。
2.5 MeHNL11 Has Transcriptional Activation Ability and Can Form Oligomers in the Nucleus
当MeHNL11与LUC的N端和C端融合时，使用萤火虫荧光素酶互补成像测定法，在共感染MeHNL11-cLUC和MeHNL11-nLUC的烟草叶片中检测到萤火虫荧光。同时，双分子荧光互补测定也证明MeHNL11可以形成同源二聚体和多聚体，这些寡聚体分布在细胞核和细胞质中。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，MeHNL11-GFP融合蛋白在细胞质中以同源二聚体形式存在。当用强还原剂二硫苏糖醇处理以破坏二硫键时，几乎所有二聚体都解离为单体。更重要的是，在细胞核内，MeHNL11-GFP融合蛋白以寡聚体形式存在。经过DTT处理后，只有一部分MeHNL11-GFP蛋白质解聚成单体。总之，这些结果表明MeHNL11可以通过二硫键形成寡聚体。
一方面，低氮处理能触发MeHNL11转位入核，并在核内形成寡聚体。另一方面，酵母单杂交实验证明MeHNL11可以与MeCAS1b启动子结合。结合这些发现，可以合理地推测MeHNL11不仅可以作为羟基腈裂解酶发挥功能，还可以在调节其下游基因的转录中发挥作用。因此，使用酵母双杂交实验研究了MeHNL11的转录激活能力。结果表明，共转染PGBKT7-MeHNL11和pGADT7的Y2H菌株在选择性培养基上生长，并在含有X-α-Gal的培养基上变蓝。这证实了MeHNL11具有激活转录的能力。
2.6 MeHNL11 Binds to the MeCAS1bPromoter and Activates the Transcription Activity of MeCAS1b
为了阐明MeHNL11在低氮胁迫下对MeCAS1b的调节作用，构建了一系列pAbAi诱饵载体。这些载体包含MeCAS1b启动子的全长序列或截短片段。随后，将这些构建体与猎物载体在Y1H测定中进行测试。结果表明，只有PF和P4片段与MeHNL11存在相互作用，表明结合位点可能位于-670至-552 bp区域。为了进一步缩小结合位点，将-670至-552 bp区域细分为4个片段，并与MeHNL11进行了额外的Y1H测定。结果表明，MeHNL11结合到S1和S2片段，其中对S2片段的结合亲和力明显更强。
为了确定MeHNL11是否能在体内结合MeCAS1b的启动子，在转染了35S:HNL11-GFP构建体的木薯原生质体上进行了染色质免疫沉淀测定。ChIP-qPCR结果表明，免疫沉淀的DNA中C3区域显著富集，表明MeHNL11确实在体内与MeCAS1b启动子相互作用。此外，S2片段位于C3区域内，进一步支持了MeHNL11在体内真正结合S2片段的推断。
进一步将S2片段用作电泳迁移率变动测定实验的DNA探针。当MeHNL11-MBP与S2标记探针孵育时，观察到了指示DNA-蛋白质复合物的阻滞条带。而且，随着竞争性探针浓度的增加，阻滞条带的强度逐渐减弱。这表明MeHNL11能够在体外结合S2片段。
进一步使用双荧光素酶系统来确定MeHNL11对MeCAS1b的调节作用。观察到，与对照组相比，共转染62-SK-MeHNL11和MeCAS1bpro的细胞中LUC发光和LUC/REN比值显著升高。这表明MeHNL11正向调节MeCAS1b的转录活性。总之，MeHNL11不仅结合到MeCAS1b的启动子，还调节其转录活性。因此，可以推断MeHNL11表现出转录因子的完整特征。
2.7 The Monomeric Form of MeHNL11 Exhibits Enhanced Transcriptional Activation Capacity
MeHNL11含有四个半胱氨酸残基。其中，Cys13、Cys82和Cys163在MeHNLs家族中高度保守，而Cys245是MeHNL11所独有的。为了研究这些半胱氨酸在MeHNL11二聚化中的作用，构建了每个半胱氨酸位点的点突变表达载体，并在烟草中瞬时表达。结果显示，独特的Cys245残基的突变使MeHNL11完全解离为单体，而其他半胱氨酸位点的突变在DTT处理后可以进一步将MeHNL11寡聚体解离为单体，表明Cys245是介导MeHNL11二聚体形成的关键残基。
为了比较单体形式和寡聚体形式的MeHNL11的DNA结合能力，使用生物素标记的MeCAS1b启动子S2片段作为探针，并分别用DTT或H2O2预处理的MeHNL11-MBP重组蛋白进行了电泳迁移率变动测定。结果表明，促进MeHNL11单体状态的DTT处理显著增强了其与S2片段的结合。相反，有利于寡聚体形成的H2O2处理显著降低了其DNA结合亲和力。此外，双荧光素酶测定证实，MeHNL11C245S突变体的转录激活能力显著强于野生型MeHNL11。这些数据共同表明，MeHNL11的单体形式与其寡聚体形式相比具有更强的转录激活能力。
上述研究表明氰化物可以诱导MeCAS1b基因表达的上调。为了检验氰化物是否也参与调节MeHNL11的单体化，将来自野生型和cyp79d1/d2双突变体叶片的粗蛋白提取物与H2O2预处理的MeHNL11-MBP重组蛋白一起孵育。蛋白质印迹结果显示，与cyp79d1/d2突变体相比，来自野生型的粗提取物诱导了更显著的MeHNL11-MBP单体化，表明内源产生的氰化物促进了MeHNL11从寡聚体形式向单体形式的转化，从而诱导了MeCAS1b的上调。
3.1 MeHNL11 Is a Hydroxynitrile Lyase With Transcriptional Regulatory Activity
越来越多的研究表明，在动植物的生命进化过程中，某些双功能蛋白已经进化出来，以更有效地维持细胞代谢稳态。这些蛋白质不仅具有酶催化功能，还参与特定基因的转录调控。这些双功能蛋白参与转录调控通常可以分为两类。第一类涉及调节染色质状态以影响靶基因的转录。第二类涉及通过直接结合靶基因的启动子来调节转录。这些例子生动地强调了双功能蛋白在调节细胞代谢和基因表达方面的多功能性，以及它们在确保细胞在不同环境条件下生存的关键作用。
在产氰植物中，HNL通过分解氰醇释放剧毒的氢氰酸，在抵御植食性昆虫侵袭方面起着至关重要的作用。最初，人们认为HNL主要在细胞质中发挥作用，但最近的发现揭示了除了其众所周知的氰醇分解作用外，HNL还可能在转录调控中发挥作用。例如，AtHNL被发现分布在细胞质和细胞核中。在这项研究中，MeHNL11被鉴定为可以与MeCAS1b启动子-612 bp至-576 bp区域结合，并被证明具有转录激活能力。其在体内和体外与MeCAS1b启动子的结合能力得到了进一步验证。值得注意的是，当暴露于低硝酸盐胁迫时，MeHNL11在细胞核中的定位比例更高。基于这些发现，本文提出MeHNL11作为一种氰醇分解酶，同时对其靶基因MeCAS1b发挥转录调控作用。
3.2 MeHNL11 Forms Oligomers and Is Sequestered in the Nucleus Upon Low N Stress
转录因子通常具有核定位信号，指导其在细胞质中合成后进入细胞核。然而，一些转录因子在正常情况下保留在细胞质中，并在特定的环境刺激下迅速转移到细胞核，从而精确调控特定基因的转录活性。这种机制与磷酸化/去磷酸化修饰密切相关。先前的研究表明，在NO3-暴露后，NRT1.1-CNGC15模块促进Ca2+内流，激活CPKs使其磷酸化核心氮响应调节基因如NLP7，并促进它们的核转位。
在这项研究中，发现低氮促进了MeHNL11在细胞核中的积累。MeHNL11可以通过二硫键在细胞质中形成同源二聚体。但在细胞核中，除了二聚体外，还形成了更高级的MeHNL11多聚体。这种寡聚体形式可能有助于MeHNL11在细胞核内的滞留。研究者特别对MeHNL11在细胞核内滞留的机制感兴趣，从三个方面考虑：磷酸化修饰、与其他蛋白质形成复合物，以及其产物HCN的翻译后修饰。先前的研究报道ACC氧化酶可以被S-氰基化修饰，该修饰通过裂解ACC产生HCN。类似地，作为氰化物产生酶，MeHNL11本身也可能发生S-氰基化修饰。这种修饰可能通过改变MeHNL11的构象，从而促进其进入细胞核。此外，MeHNL11是作为二聚体直接进入细胞核，还是先解离为单体，仍有待研究。
3.3 The C245 and L29 Mutations Confer Dual Functionality of MeHNL11 as a Metabolic Enzyme and a Transcriptional Regulator
先前的研究表明，木薯MeHNL家族成员通常以寡聚体形式发挥功能，本研究也发现MeHNL11主要以寡聚体形式存在。然而，二聚体/多聚体的形成依赖于其第245位独特的半胱氨酸残基。该位点的突变导致MeHNL11完全解离为单体，并显著增强其转录激活能力。一方面，C245位点是其正常酶功能所必需的；另一方面，它可能充当加速其转录调节活性的分子开关，使MeHNL11能够响应氰化物或低氮胁迫信号，从而促进从寡聚体向单体的转变，并实现对MeCAS1b转录活性的精确调节。此外，MeHNL11在第29位含有一个独特的亮氨酸残基；这个残基可能有助于形成类似亮氨酸拉链的结构，这可能赋予MeHNL11 DNA结合活性，从而使单体也具备类似转录因子的功能。总之，C245和L29的存在赋予了MeHNL11作为代谢酶和转录因子的双重功能。
3.4 MeHNL11 Is a HCN Producer and a Sen
