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这篇综述系统阐述了利用先进的成像与遗传学工具研究模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）胚胎发生的进展。文章详述了从合子不对称分裂建立顶端-基轴（apical–basal axis）到器官起始的整个过程，强调了局部生长素（auxin）生物合成、PIN（PIN-FORMED）蛋白介导的极性运输及其下游转录响应（如MONOPTEROS, WOX）的核心调控作用。综述重点介绍了包括组织透明化、三维形态计量、活体胚珠成像与单细胞激光消融在内的关键技术突破，展示了这些方法如何推动对植物体轴建立、细胞命运决定和模式形成机制的理解，将拟南芥胚胎确立为解析植物发育化学与生物物理线索的优选模型。
拟南芥胚胎发生的进展
植物与动物一样，生命始于单个细胞——合子。合子经过一系列细胞分裂，建立起植物胚胎。尽管植物胚胎发育和模式在整个植物界差异巨大，但模式物种拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）的胚胎发生遵循高度可预测的细胞分裂和分化轨迹。其刻板式的细胞分裂、扩展模式以及强大的遗传学工具，使得大部分植物胚胎研究都聚焦于这一模型。
拟南芥胚胎发生始于合子的不对称横向分裂，产生基细胞和顶细胞。基细胞将形成胚柄（一种连接胚胎与母体组织的胚外支持结构），而顶细胞将产生大部分原胚细胞，并最终发育为幼苗。合子的这次分裂是第一个关键的图式形成事件，建立了未来植物体的顶端-基轴。顶细胞随后经历两次平周分裂，产生4细胞胚胎；再进行第二轮平周分裂，产生具有原表皮层和新生径向对称的8细胞原胚。此时，原表皮和基本组织之间出现区分，径向模式开始显现，这将导致胚胎后根中一系列同心圆筒状的不同细胞类型。在另一轮分裂后，在胚胎32细胞阶段，胚柄最顶端的细胞（胚根原）进行不对称分裂，产生两个子细胞——一个上方的透镜状细胞和一个下方的细胞。这些细胞经历从胚外到胚胎的身份转换，并产生未来的静止中心和根冠柱状细胞。不久之后，球形胚胎的上边缘扩展，形成具有初生双侧对称的三角形过渡阶段胚胎。子叶从三角形上顶点的持续外生长中形成，产生了恰如其名的心形期胚胎。胚胎进一步伸长，产生鱼雷期和子叶弯曲期，胚胎逐渐获得未来幼苗的形状。
以生长素为中心的遗传与激素机制
早期对拟南芥胚胎发生的研究受果蝇研究的启发，研究人员进行了类似的遗传筛选，旨在识别具有胚胎图式缺陷的突变体。我们对胚胎图式形成的分子机制理解，大部分源于这一早期的遗传学基础工作及随后对相应基因的分子表征。值得注意的是，通过这种方法发现的一些最著名的突变体，包括topless、monopteros (mp)、bodenlos (bdl)和gnom，后来被发现与植物激素生长素的信号或运输有关。
在过去的三十年中，生长素在植物胚胎发生中的作用得到了深入研究，从而形成了一个关于该激素如何贡献于植物胚胎图式形成的稳健模型。生长素在胚胎发生的最早阶段就参与其中；它可能在母体组织（如胚珠珠被）中合成，并运输至胚胎基部。然后，生长素通过胚柄中的PIN7生长素转运蛋白的活性被运输到早期胚胎顶端，在那里积累并有助于顶端细胞身份的确定。大约在16细胞胚胎阶段，一个新的生长素源在原胚的顶端出现。在最上层的原表皮细胞中合成的生长素，然后通过基底定位的PIN1，穿过原胚内部朝向其基部（即根极）运输，在那里积累，启动转录响应，并诱导根顶端分生组织的形成。此外，AUX1/LAX介导的生长素流入也对胚胎图式形成有决定性贡献，但其作用尚不十分明确。
破坏这些生长素机制所导致的胚胎图式缺陷通常包括：（i）顶端/基部细胞边界早期建立的缺陷，例如在pin7、bdl、mp或生长素生物合成突变体中；（ii）根极特化的缺陷，例如在多个pin突变体或PINOID过表达子中，或在mp或bdl中；以及（iii）子叶特化的缺陷（在大多数上述突变体中）。这些著名突变体的表型吸引了研究人员的注意，最终引导他们描述了早期胚胎图式形成背后的遗传和分子过程。
尽管20世纪90年代末和21世纪初的拟南芥胚胎发生研究存在某种以生长素为中心的偏向，但合子的极性及1细胞期胚胎顶端-基部极性的建立需要WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX (WOX)基因的活性。顶细胞和基细胞及其后续组织身份的细胞命运调控由WOX2和WOX8分别介导，它们在卵细胞和合子中共表达。合子第一次分裂后，WOX2被限制在顶端谱系，WOX8被限制在（基部的）胚柄细胞中，显示了这两个主要发育轨迹之间的强烈划分。然而，WOX也与生长素介导的过程相关联，因为它们汇聚于MP信号通路并影响PIN1的表达。
其他值得注意的、有助于我们理解植物发育的胚胎图式形成突变体还包括：调节径向和其他图式形成过程的SHORT ROOT (SHR)和SCARECROW (SCR)；参与合子极化的MAP激酶信号通路组成部分YODA；以及定义根身份的PLETHORA转录因子。特别是，YODA–MPK3/6信号模块介导的ICE1/SCRM转录因子磷酸化，作为一种与生长素并行作用并汇聚于WOX转录因子以调节合子极化和早期顶端-基部图式形成的机制出现。
植物胚胎的透明化用于显微分析
拟南芥胚胎在角果内的胚珠中发育。深埋于几层母体组织之下，使得观察和分析其发育的方法变得复杂。早期，胚胎学家采用组织切片方法来记录胚胎形状、细胞组织和图式。后来，应用了整体组织透明法，使用基于Hoyer氯醛水合物的溶液，允许更容易地观察完整胚珠内任何阶段的胚胎。随着共聚焦显微镜成为标准成像方法，优化透明方法的努力集中在保护报告蛋白的荧光和克服光散射的限制上。随着时间的推移，出现了用于荧光成像的不同透明溶液，具有不同的效用。诸如ClearSee或2,2\‘-硫代二乙醇（TDE）等化学品已被用于透明胚珠组织层，以观察其下的胚胎。近年来，Attuluri等人比较了不同的透明方法，并根据不同特性（如透明效率、样品形态变化和光谱特性）对它们进行了评分。
为了详细研究胚胎图式，需要分辨单个胚胎细胞的轮廓，因为细胞壁方向是表明细胞分裂面和形状的关键信息。研究人员使用如FM4-64等染料对质膜或细胞壁进行染色。然而，这些化学品在红光部分发射，可能干扰其他染料，并且通常无法深入渗透到组织中。在过去十年中，SCRIRennaissance 2200 (SR2200)染色剂常被用于染色胚胎的细胞壁。SR2200是一种光学增白剂，可与细胞壁中的β-葡聚糖结合，最初用于真菌，后适用于拟南芥胚胎。该方案被进一步修改，将SR2200与TDE透明化结合，允许在完整胚珠内观察胚胎。SR2200的发射光谱与DAPI非常相似，尽管两者可以在光谱上分离，因此可以与整个光谱范围内的荧光蛋白在共聚焦成像中结合使用。Musielak等人制定了一个高效且易于使用的方案，可用于提取的胚胎，以可视化胚胎图式以及不同亚细胞区室中的荧光报告蛋白。
拟南芥胚胎的三维形态计量分析
使用SR2200染料染色拟南芥胚胎细胞壁，使得在三维（3D）中研究胚胎图式成为可能，将我们的视角从典型的、已透明的2D图像（使用经典透明方法无法立即区分2细胞和4细胞期胚胎）改变过来。SR2200染色允许测量细胞体积，并深入了解细胞分裂面的方向。基于SR2200染色的胚胎Z-stack对单个细胞进行分割，得以生成胚胎发生的发育图谱。这种方法有助于剖析拟南芥胚胎发生过程中的细胞分裂方向，表明图式是通过避免“穿过细胞的最短壁”路径而产生的，并且这种偏离是由生长素触发的。后续工作进一步表明，细胞分裂的方向可以预测，并且似乎依赖于与母细胞中心的距离以及细胞核的定位。这种系统方法也被用于研究依赖于生长素响应的细胞骨架组织，这导致了不对称分裂，并最终决定了胚胎细胞的几何形状。有趣的是，Chakrabortty等人表明，微管阵列方向的组织可以预测胚胎中的分裂面。将这种方法与大规模计算分析相结合，Laruelle等人对胚胎发生过程中细胞分裂模式的变异性进行了深入探究，也暗示母体细胞几何可能影响细胞分裂的图式。
胚珠培养和药理学处理
我们到目前为止讨论的方法基于观察固定胚胎（无论是在完整胚珠内还是从中提取）；这些方法都不允许对胚胎进行活体成像。活体成像可以解决固定样品难以捕捉的过程，如细胞周期长度、蛋白质周转、或细胞对激素和其他信号的瞬时响应。为了实现活体成像，必须建立功能性胚胎或胚珠培养，因为在完整角果内可视化胚胎似乎不可行。胚珠培养允许合子胚胎在类似于拟南芥角果内的生物学背景下发育。体细胞胚胎培养已用于许多研究，但体细胞胚胎发生不一定完全重现合子胚胎发生，并且取决于培养基成分以及组织的来源。Sauer和Friml首次描述了一种专注于胚胎发生研究的拟南芥胚珠培养方法。作者使用改良的Murashige和Skoog培养基，添加了植物凝胶和谷氨酰胺，这使得从1细胞期到成体植物的正常胚胎发生成为可能。之后，胚珠培养基得到了改进，作者使用基于Nitsch培养基的溶液并添加海藻糖，同样可以从含有1细胞期胚胎的体外培养胚珠中完全重建出成体植物。值得注意的是，在这种培养基中培养的胚珠显示出更高的存活率，大多数胚胎遵循正常的发育模式。尽管这些方法仍有局限，但开发这种相对方便的胚珠培养方法使得研究人员能够通过化学方法影响细胞和发育过程，以剖析它们对胚胎发生的贡献。处理涉及操纵生长素运输、囊泡运输和细胞骨架，最近还涉及细胞分裂，突显了该方法的适用性。这种“药理学”方法的发展无疑是研究胚胎发生机制的有力工具，无疑将为植物胚胎研究开辟新的途径和视角。
拟南芥胚胎的活细胞成像
胚珠培养方法的成功发展以及显微工具的显著进步，导致了活细胞成像方法的发展。各种植物组织的活细胞成像提供了在精确时空尺度上直接观察（亚）细胞动力学的机会，并为不同的细胞和发育过程提供了前所未有的见解。此外，它允许更严格地跟踪实验操作后细胞和组织的变化。不幸的是，植物胚胎是一种难以进行活细胞成像的样品类型。Long等人开发了一种方法学方法，用于在活的心形期拟南芥胚胎中进行蛋白质-蛋白质相互作用。尽管该技术有监测蛋白质相互作用的潜力，但它不能提供对非常早期胚胎的观察，也不能进行长时间的专用成像。活体成像的另一个值得注意的例子（尽管仅在体细胞胚胎上）为了解体细胞重编程为全能状态并最终导致植物再生的机制提供了关键见解。
一个重要的突破是长期成像在胚珠内生长的拟南芥胚胎的方法。该实验设置基于微流体聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置的变体，浸没在含有海藻糖的Nitsch营养培养基中，并通过荧光显微镜（通常是多光子或转盘系统）进行观察。这使得可以使用长工作距离物镜追踪从第一次合子分裂直到心形期的胚胎。使用这种方法取得了多项重要发现，例如，绘制了分裂过程中顶细胞和基细胞身份的轨迹，或证实胚乳发育对于早期胚胎中细胞命运特化的启动并非必需。该设置还被用于研究与以下过程相关的胚胎发育：胚柄来源的胚胎发生、线粒体动力学、细胞骨架动力学和液泡分布。在同一报告中，这种活体成像设置与激光消融系统耦合，这是植物发育生物学方法工具箱的一个令人印象深刻的补充。该系统被用于精确破坏单个细胞，例如，显示在破坏一个顶细胞后，其正下方的基细胞来源的子细胞会改变其身份，成为一个新的顶细胞。这一观察表明存在胚胎顶端优势，即顶细胞抑制了基细胞的顶端特化和增殖。长期成像胚胎的可能性，加上单细胞激光消融等仪器，是令人兴奋的，因为它为重新审视旧的研究问题和解决新的问题开辟了途径。
展望与视角
在过去的四十年中，我们目睹了应用于植物胚胎发生的稳定技术进步；最明显的是在成像、遗传学和组学方法方面。它们很大程度上利用了生物医学研究的进展，并利用了那里技术的惊人进步。最初只是少数爱好者的特定领域，方法学的发展与20世纪90年代专注于幼苗和胚胎图式形成过程的里程碑式遗传筛选以及随后相应基因的分子表征相结合，将拟南芥胚胎发生转变为一个高度相关的模型系统，在植物发育、细胞生物学和信号传导领域产生了关键见解。从那时起，我们目睹了对研究植物胚胎发生的兴趣日益增长，超越了经典的拟南芥模型系统，并扩展到单子叶植物。
尽管发生在发育中种子这一固有复杂的环境中，但当在胚胎中研究时，细胞分裂方向、细胞极化和细胞特化等过程通常在比后期发育阶段更少的细胞和组织类型环境中发生，从而为探索这些基本发育过程背后的机制提供了极佳的模型。我们可以预期，动态三维几何模型的发展和细胞命运特异性标记物的使用将继续成为植物胚胎学家发育研究的焦点，因为它们显然有潜力回答许多与细胞分裂控制和组织图式及其对体形形成贡献相关的问题。另一方面，将活细胞成像方法应用于植物胚胎本身就是一个非常引人入胜的可能性，其高度技术性的性质可能有助于推动植物发育研究的显微镜组件整体发展。结合遗传学、激素生理学和生物物理学，活细胞成像有潜力解决植物发育生物学许多领域的长期存在的问题，超越胚胎发生。在活体胚胎上进行单细胞激光消融的可能性将进一步有助于解决其他基本问题——主要是那些与细胞间通讯相关的、有助于建立和维持细胞和组织命运的问题。这些方法的结合也将有助于理清母体珠被与合子细胞之间通过胚柄进行的多层通讯途径。尽管这种方法技术要求高且有局限性，但就植物胚胎发生相关的一切而言，坚持和奉献将导致掌握和标准化此类方法。尽管存在所有技术挑战，持续的方法学进步继续扩大了对植物胚胎发生的实验访问。特别是随着几乎任何潜在陆地植物模型的基因组触手可及，下一个前沿是比较和进化胚胎发生。因此，植物胚胎学领域的未来进展将受益于新兴成像、遗传学、基因组学、转录组学和计算方法的整合，从而能够对植物胚胎发育进行更全面的分析。
