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这篇综述聚焦于细胞外囊泡（EVs），系统阐述了其生物发生机制、内膜系统的生物物理性质，并重点探讨了EVs膜上离子通道和转运体的存在、功能及其调控作用。文章还概述了检测外泌体中功能性离子通道的现有方法，并展望了其在细胞生理与疾病发病机制中的新兴意义。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是几乎所有细胞类型都会分泌到细胞外环境中的一类异质性脂质双层包被颗粒。它们曾被认为是细胞碎片，如今则被视作具有生物活性的实体，能够将蛋白质、脂质和核酸等分子货物转运至受体细胞，从而调控细胞功能，参与细胞间通讯。EVs在免疫调节、信号转导和抗原呈递中发挥着关键作用，其分子货物反映了亲代细胞的生理或病理状态，使其在癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等多种疾病中具有作为诊断和预后生物标志物的潜力。传统上，EVs根据大小和生物发生方式被分为外泌体（exosomes）、微泡（microvesicles）和凋亡小体（apoptotic bodies），而近期研究已将其分类扩展至包括具有独特生物物理和分子特征的新型亚型，如超微粒（supermeres）、外泌体（exomeres）、迁移体（migrasomes）等。
EVs的生物发生
EVs的生物发生是一个涉及多种途径和组件的复杂过程。通常，EVs由晚期内体通过多泡体（Multivesicular Body, MVB）膜向内出芽形成腔内囊泡（Intraluminal Vesicles, ILVs），随后释放到细胞外空间。EV生物发生可 broadly 分为两大主要途径：运输所需内体分选复合物（Endosomal Sorting Complex Required for Transport, ESCRT）依赖途径和ESCRT非依赖途径。
ESCRT机制对于MVB内ILVs的出芽至关重要，其中ESCRT-0、I、II和III等关键蛋白复合物负责启动MVB形成、囊泡出芽和货物分选过程。ESCRT-0主要负责识别和结合早期内体上的泛素化货物，随后ESCRT-I和II进一步协助将这些货物蛋白分选进入MVB内的ILVs，最后由ESCRT-III介导ILVs从内体限制膜出芽进入其腔内。MVB形成后，既可与人溶酶体融合进行降解，也可与质膜融合释放EVs。EV蛋白Alix与多种ESCRT组件（如TSG101和CHMP4）相互作用，被认为在内体膜出芽、膜分裂和通过其与多配体聚糖（syndecan）的相互作用选择EV货物中发挥作用。
与ESCRT依赖机制不同，ESCRT非依赖途径绕过了传统的ESCRT蛋白，依赖于神经酰胺代谢，其中鞘磷脂合酶2（SMS2）促进的神经酰胺合成有助于EV的生物发生。神经酰胺促进膜弯曲，有助于ILVs从内体膜出芽。在货物分选方面，四跨膜蛋白家族（如CD9、CD63、CD81）是ESCRT非依赖途径中的重要贡献者，它们参与组织脂筏并促进膜蛋白簇集，从而影响EV内特定货物的分选和富集。Rab GTP酶，特别是Rab31，在此途径中发挥着关键调节作用，控制着不依赖于ESCRT组分的ILVs来源EVs的分泌。
其他调控EV生物发生的因素包括蛋白质的翻译后修饰（如SNAP23和Alix的修饰）、多配体聚糖及其相关伙伴的机制作用，以及微环境和外部刺激（如炎症反应和促炎细胞因子水平升高）的影响。细胞类型及其生理病理状态导致EV在脂质组成、蛋白质含量和RNA谱方面的显著差异，这极大地导致了EV的异质性。
内膜的生物物理特性
EVs的电生理特性深受其表面电荷的影响，表面电荷在胶体稳定性、细胞摄取和生物分布中起关键作用。EVs通常呈现负zeta电位，这主要归因于其脂质双分子层外叶上存在带负电的磷脂，如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇。此外，整体膜蛋白、糖基化模式以及外叶与周围离子和带电生物分子的相互作用也影响表面电荷。细胞外条件，如pH、离子强度和二价阳离子（如Ca2+、Mg2+）的存在，可进一步调节EVs的静电特性。
影响EVs生物物理特性的另一个关键因素是跨脂膜的离子通量。由于脂质双层对离子不通透，离子的移动通过各种膜上的通道和转运体进行。离子通过通道的通量有助于膜电位，我们预计它可能调节EVs的表面特性。跨膜的离子梯度通过依赖能量的过程（通过初级或次级主动运输）维持，产生了离子跨膜移动的驱动力。膜电位在信号机制、电信号、细胞兴奋性、增殖、存活和分化等众多细胞过程中起着至关重要的作用。
类似于质膜，细胞内细胞器膜维持着对其特殊功能至关重要的独特离子微环境。内质网作为主要的Ca2+库，腔内Ca2+浓度约为0.5-1 mM，同时维持高K+和相当的Na+浓度。高尔基体具有相似的离子特征，Ca2+浓度为0.1-0.3 mM，K+约为100 mM。线粒体基质中的离子浓度受到严格调控以支持生物能量和信号功能，K+水平维持在约150-180 mM，Ca2+浓度在静息时约为40 nM，刺激期间可达约1 μM。晚期内体表现出显著不同的离子分布，具有低K+、高Na+和酸性pH。另一个影响内膜生物物理特性的决定因素是膜的流动性和脂质堆积。内质网的特点是脂质堆积松散，而富含饱和脂质和胆固醇的质膜则堆积紧密。这种跨分泌途径的膜有序梯度对蛋白质折叠和离子通道运输具有功能意义。脂质对离子通道的调节分为：（a）直接的脂质-蛋白质相互作用；（b）通过膜性质的间接调节。因此，我们推测EVs来源于生物膜将影响离子通道的表达及其功能。
离子通道和转运体
Ca2+在广泛的细胞过程中起着至关重要的作用，作为通用第二信使，它影响细胞骨架运动、酶活性以及神经递质等分子的分泌。类似地，多项研究探索了细胞内Ca2+浓度升高与EV产量增加之间的机制联系，囊泡运输高度依赖于Ca2+，因为Ca2+是供体细胞内囊泡出芽和融合过程不可或缺的。细胞内Ca2+水平升高已知有助于EVs释放所必需的膜融合事件。
EVs的电学表征揭示了电压依赖性和pH敏感电流。这种行为与掺有各种膜相关蛋白的脂质双层膜的存在一致。在这些蛋白质中，有几个作为离子通道，促进离子跨EV膜转运。这解释了观察到的EVs的pH依赖性电导率，这可能是通过这些膜通道改变的离子转运动力学所致。此外，Na+转运体也已在EV膜上被鉴定出来。Na+/H+交换体3在尿液EVs中被检测到，并由于其肾脏生理中Na+重吸收和液体平衡的关键作用，被认为是肾损伤的潜在生物标志物。同样，多种离子转运体和交换体已在EV膜上被报道。我们推测这些离子通道和转运体通过介导离子跨EV膜的可控移动来帮助维持离子平衡，从而保持对EV体积调节、pH稳态和生理信号传导至关重要的电化学梯度。
EVs中的离子通道有助于调节其离子组成、结构稳定性和生物分子货物的可控释放。值得注意的是，编码大电导钙激活和电压门控钾（BKCa）通道的Kcnma1基因的功能活性已在小鼠血浆来源的EVs中被记录。BKCa通道对维持EVs的结构和功能完整性至关重要，并在选择性货物包装中起关键作用。此外，表达囊性纤维化跨膜电导调节因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR）锌指融合蛋白的工程化间充质干细胞来源EVs已被证明可激活CFTR转录并恢复人支气管上皮细胞中的氯离子（Cl-）转运。EVs中存在多种尺寸表明体积调节的作用，可能由Cl-通道介导。另一个Cl-通道，氯离子细胞内通道4（CLIC4），已在乳腺癌细胞释放的循环EVs中被鉴定。EVs通道和转运体的能力，加上其多样的蛋白质、RNA和其他生物分子货物，使它们成为癌症进展、神经元信号传导和组织再生等各种生物过程中的关键参与者。EVs中的通道活性可能潜在地调节EVs内的内容物，使其成为理解疾病机制和潜在治疗靶点的重要工具。
通过EV内容物调控离子通道
EVs作为动态信号实体，通过直接相互作用、细胞内信号通路和转录后调控，传递调节离子通道活性的分子货物。连接蛋白可以在EV膜和受体细胞之间形成功能通道，蛋白质组学分析已在多种细胞类型来源的EVs中鉴定出Cx43、Cx45和Cx32等连接蛋白亚型。这些连接蛋白促进离子和信号分子的转移，从而调节靶细胞中离子通道的功能状态。值得注意的是，Cx43已被证明可在EV表面形成功能性半通道，从而使货物（如荧光素）释放到受体细胞中。
EVs影响离子通道功能的另一个突出机制是通过转移信号分子和调节蛋白。来自远程缺血预处理小鼠心脏的循环EVs表现出miR-144水平升高，这与蛋白激酶B（AKT）、糖原合酶激酶3β（GSK3β）和p44/42丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化增加相关。类似地，来自爱泼斯坦-巴尔病毒感染的鼻咽癌细胞的外泌体含有潜伏膜蛋白1（LMP1），可激活受体细胞中的细胞外信号调节激酶（ERK）和AKT信号通路。这些信号级联已知可调节离子通道活性。
除了蛋白质介导的机制，EV货物还包括多种非编码RNA，特别是微小RNA（miRNAs），它们在转录后基因调控中起着关键作用。miRNAs通过靶向特定mRNA来调节离子通道的表达，从而影响神经元兴奋性、心脏电生理和细胞稳态等生理过程。通过EVs递送miRNAs使得能够调节内在和受体细胞的离子通道活性，并将其整合到更广泛的调控网络中。许多与离子通道调控相关的miRNAs已在EV货物中被鉴定。因此，miRNA对离子通道活性的调控代表了一种多方面的相互作用，涉及直接的mRNA靶向、影响miRNA表达的反馈机制，以及在不同生理和病理背景下对离子通道功能的调节。
测量EVs中离子通道活性的方法
多年来，人们发现了广泛的工具来测量离子通道的功能活性。这些工具包括平面双层膜、膜片钳、电流分析法、基于荧光的测定和通量工具。因此，我们总结了一些可用于理解EV膜上离子通道活性的方法。
平面脂质双层（Planar Lipid Bilayers, PLB）技术是离子通道研究的基石，因为它能够在明确定义的条件下进行高分辨率、单通道记录。这种方法允许对离子通道功能进行详细的分子表征，包括使用特定的通道激活剂和抑制剂的药理学分析。典型的PLB设置由一个双室系统组成：cis和trans隔室，由脂质双层上的一个小孔分隔。在添加膜囊泡后，可以测量响应电化学梯度的离子电流和膜电位，从而获得关于离子电导和通道门控机制的关键见解。
膜片钳技术通过使用玻璃微管与细胞膜形成高电阻封接，实现了对生物膜中单个离子通道离子电流的精确测量。传统上，该技术应用于完整细胞。然而，该技术在其可用于膜片钳研究的细胞器尺寸上存在限制；EVs相对较小，使其不适合进行膜片钳研究。一项重大进展是将膜片钳技术外推到人工系统，如用于在受控环境中研究离子通道活性的脂质体。因此，使用膜融合的巨型单层囊泡或脂质体的替代方法可能有助于识别天然的EV通道。
电流测量法使用聚吡咯掺杂十二烷基苯磺酸盐作为氧化还原活性导电聚合物，以检测生物组织附近的局部离子变化。这种传感方法，称为近场电生理学，已用于测量神经元、化学感受器、癌细胞中的K+通道活性以及大鼠纹状体和海马的组织氧水平。该技术首次应用于测量完整EVs中的K+电流。放置在EVs附近的K+驱动器，记录了完整囊泡中伊比利亚毒素敏感的BKCa通道的活性。此外，结合数学建模和动力学研究的近场电生理学可以估计EVs的内部离子浓度、每个EVs的通道数量，以及响应通道阻滞剂、膜破坏或施加化学梯度的跨膜离子运动。
基因编码指示剂（Genetically Encoded Indicators, GEIs）通过实现对细胞内离子动力学的实时、无创监测，改变了细胞信号传导的研究。这些工具在量化特定亚细胞区室内的离子浓度方面特别有价值，为了解生理和病理过程提供了见解。为了实现亚细胞分辨率，这些GEIs通常被设计有细胞器靶向序列或与驻留的细胞器蛋白融合，从而能够精确定位到线粒体、内质网、高尔基体和溶酶体等区室。这种空间靶向增强了解析生理和病理条件下区室特异性离子动力学的能
力。此外，GEIs的应用正在扩展到EV研究，因为它提供了可靠的测量。鉴于其模块化设计和灵敏度，GEIs有望表征外泌体和其他EVs的离子组成，可能为细胞间通讯和疾病生物标志物提供新的见解。
EVs的治疗应用
癌症
EVs因其在细胞间通讯中的多方面作用及其作为治疗载体的潜力，在癌症治疗中引起了极大的兴趣。值得注意的是，工程化外泌体已被报道可增强RNA干扰药物和化疗药物直接向肿瘤的递送，有效减轻了传统药物递送方法常见的不良反应。外泌体的治疗应用扩展到其作为免疫治疗剂的功能。正在开发基于外泌体的免疫疗法来操纵T细胞反应和增强抗肿瘤免疫。这一策略得到了证据的支持，证明外泌体可以被设计成携带肿瘤相关抗原，从而触发针对癌细胞的免疫反应，从而可能彻底改变癌症患者的治疗格局。
EVs还通过影响细胞生长、侵袭和转移等细胞过程来影响肿瘤微环境。此外，EVs可以促进血管形成，并有助于为癌症扩散创造条件，使其既可作为治疗靶点，又可作为监测疾病进展的有用工具。EVs反映肿瘤生理和病理状态的能力使其成为癌症诊断和预后中有前景的生物标志物。为改进药物递送而对EVs进行工程化进一步增强了其治疗潜力。EVs的生物相容性和穿越血脑屏障的能力增强了其在治疗脑转移瘤和其他先前被认为难以治疗的癌症中的重要性。EVs可以有效地递送治疗药物跨越此类屏障，因此为针对中枢神经系统肿瘤的疗法带来了希望。最后，将基于EV的治疗与现有疗法相结合可以通过提高有效性和减轻副作用来改善结果。
心血管疾病
EVs的治疗应用在心血管医学中越来越受到关注，因为它们能够在心肌损伤等损伤后支持心脏修复和再生。研究表明，心脏和间充质干细胞分泌的EVs含有生物活性分子，可以促进心肌细胞存活、抑制细胞凋亡并刺激血管生成。富含miRNAs的EVs，特别是那些来源于人脐带间充质干细胞的EVs，已被证明可通过减轻炎症和纤维化来缓解急性心肌缺血，突显了其治疗潜力。
