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为解决食管腺癌(EAC)放射抵抗的机制问题，研究人员开展了一项关于干扰素刺激基因15(ISG15)在DNA损伤反应(DDR)中作用的研究。研究发现，电离辐射(IR)诱导的ISG15可对γH2AX进行K120位点的ISGylation修饰，该修饰对稳定MDC1、促进RAD51及时募集以及高效的同源重组修复至关重要。这项研究揭示了ISG15及其ISGylation是EAC放射抵抗的关键驱动因素，为开发新的放射增敏策略提供了新靶点。
想象一下，有一种凶险的癌症，它在过去40年里发病率飙升了超过700%，而确诊后大约只有20%的患者能活过5年。这就是食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma, EAC)的现实困境。目前，针对可切除EAC的标准治疗是CROSS方案，即新辅助放化疗后再进行手术，然而，这一方案仅能使少数患者获益。更令人沮丧的是，在针对不可切除患者的治疗中，将放疗剂量从50.4 Gy提升到61.6 Gy，并未能带来临床结果的进一步改善。这凸显了EAC对放疗的固有抵抗性，即“放射抵抗”。近年来，尽管ESOPEC试验表明围手术期化疗方案(FLOT)相比CROSS方案能提高生存率，但FLOT方案本身毒性较大，不少患者难以耐受。因此，深入理解并克服EAC的放射抵抗机制，成为改善患者预后的关键突破口。
科学家们将目光投向了一个名为干扰素刺激基因15(Interferon-stimulated gene 15, ISG15)的分子。它最初以抗病毒功能为人所知，但后续研究发现其在DNA损伤修复、复制压力缓解等方面也扮演着角色。ISG15与泛素(Ubiquitin)类似，可以利用其C末端的LRGG基序，通过一个被称为“ISGylation”的酶促级联反应，共价修饰靶蛋白的赖氨酸残基，从而影响靶蛋白的稳定性、功能和相互作用网络。此前的研究表明，在未经治疗的EAC患者中，肿瘤高表达ISG15与不良生存率相关。鉴于ISG15在应对复制压力中的作用，以及强大的DNA修复能力是癌细胞产生放射抵抗的关键原因，来自密歇根大学等机构的研究团队提出了一个科学假设：ISG15是否也参与了放疗（电离辐射）引起的DNA损伤修复过程，从而促进了EAC的放射抵抗？
为了验证这一假设，并深入探索背后的分子机制，研究人员在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项研究。他们系统性地探索了ISG15在EAC细胞应对电离辐射过程中的功能，并发现了一个全新的、关键的靶蛋白修饰事件。这项研究不仅揭示了EAC放射抵抗的一条新通路，也为未来开发联合治疗策略指明了方向。
为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键的细胞与分子生物学技术。他们利用RNA干扰技术在多种EAC细胞系中敲低ISG15，并通过克隆形成存活实验评估其对照射的敏感性。DNA损伤修复能力通过碱性彗星实验进行评估。同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两种主要修复途径的效率，则通过基于GFP报告基因的I-SceI内切酶系统在Panc1和U2OS细胞中进行精确量化。为了鉴定ISG15在辐射后的修饰靶点，研究人员采用了串联质谱标签技术进行定量蛋白质组学分析，并利用免疫共沉淀结合质谱技术，直接鉴定了特异性修饰位点。蛋白质间的相互作用通过免疫共沉淀验证。关键蛋白在DNA损伤位点的动态募集与滞留过程，则通过活细胞成像技术，结合显微激光照射系统进行实时观测。此外，研究还包含了对113例化疗抵抗的EAC患者组织构建的组织芯片，通过免疫组化分析了ISG15和RAD51的表达与患者临床预后的相关性。
研究结果
辐射诱导ISG15表达，ISG15缺失增强EAC细胞的放射敏感性。
研究人员首先在7种EAC细胞系中均检测到ISG15的基础表达。敲低ISG15能显著降低所有测试细胞系的克隆形成存活率，其中Flo1细胞最为敏感。重要的是，电离辐射能以剂量依赖的方式上调EAC细胞中的ISG15表达，这可能是通过激活I型干扰素信号实现的。敲低ISG15能显著增敏Flo1和OE33细胞对辐射的敏感性。碱性彗星实验进一步表明，敲低ISG15会严重损害细胞修复辐射所致DNA损伤的能力，损伤在照射后24小时仍显著存在。
ISGylation对于高效的同源重组修复至关重要。
为了理解ISG15如何促进放射抵抗，研究人员聚焦于DNA损伤反应。他们发现，敲低ISG15的Flo1细胞在照射后，γH2AX水平持续居高不下，且无法有效启动辐射诱导的G2/M检查点阻滞。通过HR和NHEJ的GFP报告系统，他们发现敲低ISG15会导致HR修复效率下降约30%，同时引起NHEJ修复的代偿性上调。进一步的拯救实验表明，过表达具有ISGylation活性的野生型ISG15(LRGG)可以部分挽救HR缺陷，而不能发生ISGylation的突变体(LRAA)则起显性负性作用，进一步抑制HR。这证明是ISG15的ISGylation修饰功能，而非其游离形式，在HR修复中起关键作用。
H2AX是ISGylation的新型底物，在赖氨酸120位点发生修饰。
为了寻找促进高效HR修复的ISGylation底物，研究人员进行了定量蛋白质组学分析，发现组蛋白H2AX是下调显著的蛋白之一。同时，通过免疫沉淀结合质谱，他们直接鉴定出H2AX在赖氨酸120位点发生了ISGylation修饰。免疫印迹实验在辐射后的EAC细胞中，检测到了分子量更高的γH2AX条带（约30 kDa），该条带也能被ISG15抗体识别，且敲低ISG15后该条带消失。这共同证实H2AX是辐射诱导的ISGylation新底物，K120是修饰位点。
H2AX的ISGylation对于MDC1滞留在DNA损伤位点至关重要。
在HR修复中，磷酸化的H2AX(γH2AX)负责识别损伤位点并募集MDC1。研究人员利用稳定表达GFP标记的MDC1蛋白BRCT结构域的U2OS细胞，通过激光显微照射发现，敲低内源性H2AX或用K120R突变体进行拯救，会显著缩短MDC1-BRCT在损伤位点的滞留时间，但不影响其初始募集。这说明H2AX的K120 ISGylation对MDC1的滞留而非募集是关键。免疫共沉淀实验也证实K120R突变削弱了H2AX与MDC1的相互作用。进一步的细胞周期同步化实验发现，ISG15的表达水平和MDC1的滞留时间均呈现细胞周期依赖性，在S期最高，这与HR修复活跃的时期相符。
赖氨酸119、120和丝氨酸139位点的修饰协同作用于DNA损伤修复。
H2AX的K119位点已知可被泛素化修饰。研究人员发现，当K119和K120同时突变时，其丝氨酸139位点的磷酸化水平反而比单个突变时更高，这可能是一种代偿机制。在ATM抑制剂存在下，这种代偿性增强的修复能力被消除。这表明K119的泛素化、K120的ISGylation和S139的磷酸化这三种翻译后修饰协同工作，精密调控DNA损伤修复。
高RAD51表达与淋巴结阳性EAC患者的不良预后相关。
RAD51是HR修复的核心下游效应蛋白。敲低ISG15会延迟RAD51在损伤位点形成焦点。通过对113例化疗抵抗EAC患者的组织芯片分析，发现ISG15在几乎所有病例中均有表达。虽然ISG15表达强度与生存无关，但在淋巴结阳性的患者亚组中，高表达RAD51与更差的生存率显著相关。
研究结论与意义
这项研究系统性地揭示了一条此前未知的、驱动食管腺癌放射抵抗的分子通路。其核心结论是：电离辐射会上调ISG15的表达，ISG15随后对DNA损伤标志蛋白γH2AX进行K120位点的ISGylation修饰。这一新颖的翻译后修饰对于将介质蛋白MDC1稳定地“锁定”在DNA双链断裂位点至关重要，进而促进了RAD51的及时募集与同源重组修复的高效进行。当这一通路被破坏（如敲低ISG15、使用ISGylation缺陷突变体或H2AX K120R突变体），HR修复受损，癌细胞对辐射变得敏感。
研究的重大意义在于多方面：首先，在机制上，它首次将ISGylation修饰与经典的DNA损伤反应核心蛋白γH2AX的功能直接联系起来，揭示了K120 ISGylation与已知的K119泛素化、S139磷酸化协同调控DNA修复的精细网络。其次，在疾病层面，它为解释为何多数EAC患者（本研究及前期工作显示约90%的肿瘤高表达ISG15）对放化疗不敏感提供了重要的机制见解。ISG15通过促进高保真的HR修复，帮助癌细胞在基因毒性治疗下存活，成为“放射抵抗”的帮凶。最后，在转化医学价值上，该研究明确了ISG15及其ISGylation通路是潜在的治疗靶点。针对这一通路开发抑制剂，有望与现有放疗或化疗方案联合，克服EAC的抵抗性，改善患者预后。同时，研究中发现的高RAD51表达与淋巴结阳性患者不良预后的关联，也提示RAD51或可作为该高危亚组的预后标志物，甚至其抑制剂也可能带来治疗获益。总之，这项研究为攻克恶性程度高、治疗抵抗的食管腺癌提供了新的科学理解和潜在的干预策略。
