《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Fabrication and Characterization of Kafirin Microparticles Made Using Ionic Gelation Vibrational Jet Flow Technology: Influence of Processing Parameters on Physicochemical Properties
1 引言
全球可持续发展问题促使人们更多地利用食品级工业副产物和废弃物来开发新型生物材料，包括微颗粒和薄膜。在控制释放生物活性物质、药物和益生菌等应用中，来源于工业副产物的疏水蛋白因其丰富性、高结合能力以及在含水环境中的低溶解度和低消化率而显示出巨大潜力。与具有不规则、多分散碎片且表面化学性质不可控的磨碎蛋白粉相比，通过受控结构化工艺制备的微颗粒具有可控的尺寸、内部组织和均匀的形态功能。在已知的微颗粒形态中，球形因其大的表面积与体积比而备受关注，能够为体内靶点提供广泛且开放的定向。
高粱醇溶蛋白是存在于高粱籽粒及其乙醇生产高蛋白副产物——含可溶物的干酒精糟（DDGS）中的主要储藏醇溶蛋白。近期研究表明，从DDGS中高效提取和纯化高粱醇溶蛋白的方法已得到开发，并证明了其作为“绿色”聚合物替代合成材料用于生物材料生产的潜力。高粱醇溶蛋白具有高疏水-亲水氨基酸比例，可发生蒸发诱导自组装，并具有高水平二硫键交联、优异的凝胶能力和缓慢消化性。高疏水-亲水氨基酸比例是其能够自组装成球形颗粒的关键。其水不溶性，结合外源因素（如蛋白-非蛋白相互作用）和内源因素（蛋白-蛋白相互作用），赋予了高粱醇溶蛋白独特的抗水合性和缓慢消化性。此外，高粱醇溶蛋白满足GRAS（公认安全）状态、生物相容性、可生物降解性、低成本和低免疫原性等关键标准。
目前，已报道多种实验室规模制备醇溶蛋白（如玉米醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白）微颗粒的方法，包括反溶剂沉淀、共沉淀、pH循环和溶剂蒸发等。然而，大多数方法因溶剂使用量大和难以控制所得颗粒的理化性质而在商业应用上受到限制。微流控、电流体动力喷雾和机械挤压等技术已被开发用于制备水凝胶球形颗粒。
离子凝胶化振动射流技术（IGVJFT）是一种形成微颗粒的新方法，它结合了机械（如用于颗粒尺寸控制的振动喷嘴）和化学（如用于颗粒固化的离子凝胶化）过程，以生产所需尺寸和形状的颗粒。该技术在高粱醇溶蛋白颗粒形成方面优于其他已报道方法，具有能耗低、颗粒尺寸合适、重复性高、生产速度快以及工艺因素可控以便优化等优点。该技术的关键要素包括分配瓶、基于氮气的气流系统、包含可控电压、频率和喷嘴尺寸的喷嘴电极的颗粒生产单元、气流泵、频闪观测仪以及带有磁力搅拌器的聚合浴（如溶解在水中的氯化钙）。将生物聚合物溶液放入分配瓶，气流迫使其进入颗粒生产单元。然后，这种高流速的胶体溶液通过一个精密钻孔的喷嘴，在振动频率和集成电压的辅助下产生高电场，形成连续、高电荷、尺寸相等的层流液滴束。这些液滴从喷嘴喷入聚合浴，在浴中固化成稳定的固体颗粒。
本研究采用IGVJFT制备DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒。预计该技术将解决当前方法的弱点并提高放大可行性。研究使用统计预测模型生成部分因子设计（25?1）实验，以研究各种工艺参数对所获DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒性能的影响。通过部分因子设计，可以在少量实验中评估相对较多的变量。将产生大颗粒和小颗粒的运行批次通过扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）检查其形态和结构特性。可调的尺寸、孔隙率和表面电荷可能使DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒成为生物活性物质、益生菌和药物的潜在载体。本研究有望产出在功能性食品和制药行业有未来应用的固体微颗粒。
2 材料与方法
2.1 材料
实验所用材料包括偏亚硫酸氢钠、正己烷、甲醇和氯化钙，购自Sigma-Aldrich。无水乙醇和HCl购自Thermo-Fisher Scientific。研究用水经Ultrapure Technology纯化。
2.2 高粱醇溶蛋白的提取
使用先前描述的方法从DDGS中提取高粱醇溶蛋白。将研磨过筛的DDGS浸泡在含有62%（v/v）无水乙醇、0.064 M NaOH和0.22% Na2S2O5的提取溶液中。Na2S2O5用作还原剂，以裂解高粱醇溶蛋白分子内和分子间的二硫键，从而增加其在提取溶剂中的溶解度和总蛋白得率。混合物在60°C水浴中振荡孵育1小时，然后冷却至室温。样品随后在超声波水浴中于25°C超声处理5分钟。超声后的样品在1750 × g下离心20分钟。回收含有溶解高粱醇溶蛋白的上清液。进行真空蒸发以减少上清液总体积，并用6 N HCl将上清液pH调至5.0。样品静置过夜以完成沉淀，然后在室温下以1750 × g进行第二次离心10分钟。移去清澈上清液，沉淀物在40°C烘箱中干燥过夜。用无水正己烷在25°C下进行三次脱脂洗涤，每次5小时，然后倾析溶剂。残留的己烷通过在60°C烘箱中加热样品过夜去除。最终粉末经研磨，使用Mastersizer 2000测得其平均粒径为272 μm。通过元素分析测得蛋白含量为84.76 ± 0.76 g/100 g（干基），提取率约为59%。
2.3 微颗粒制备与部分因子实验设计
2.3.1 统计设计
使用Design-Expert软件为五个工艺参数生成部分因子设计（25?1），参数包括：喷嘴直径（μm）、集成电极电压（V）、内部频率/振动（Hz）、凝胶液浓度CaCl2（% w/v）和DDGS-高粱醇溶蛋白浓度（% w/v）。基于初步筛选测试，确定了每个工艺因素在技术可成功运行以生产颗粒时的最高（+1）和最低（-1）水平，并用于设计。由此生成了16个处理运行。
2.3.2 制剂与IGVJFT操作
IGVJFT的进料液制备如下：将1 g（w/v）DDGS-高粱醇溶蛋白溶解于15 mL 62%乙醇水溶液中，然后在搅拌条件下加入85 mL水（F1制剂）；或将2 g（w/v）DDGS-高粱醇溶蛋白溶解于15 mL 62%乙醇水溶液中，在搅拌条件下加入（F2制剂）。制剂使用高速磁力搅拌器混合4小时。
操作以批次模式进行。将制备好的制剂装入连接有专用泵的注射器，泵的流速设置可控。间歇使用气动辅助喷嘴以及同轴喷嘴设置来调节加工过程中的流动。操作系统根据调查因素的设定水平进行配置。加工过程中，系统的加热功能关闭，凝胶液置于磁力搅拌器上持续搅拌。通过筛分从凝胶浴中收集形成的微颗粒。然后，将16个批次的DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒在热风室中于约32°C、相对湿度维持在35%的条件下单独干燥72小时。干燥后的微颗粒储存在环境温度下防空气和防潮的灭菌玻璃管中。
2.4 微颗粒尺寸分析（PS）
使用Mastersizer 2000测定微颗粒的体积加权平均尺寸。测量前，将微颗粒分散在蒸馏水中，浓度为0.1%（w/v），以达到10%–20%的最佳遮光度。将悬浮液轻轻搅拌60秒以确保均匀分散而不引起颗粒破损。使用Hydro 2000S湿法分散单元进行测量。每个样品分析三次，结果以平均值±标准差（n = 3）报告。
2.5 Zeta电位测量（ZP）
使用Zetasizer 3000HS测量微颗粒的Zeta电位。将微颗粒以0.01%（w/v）的浓度悬浮在0.5 mL水中。使用Omni SEC-Zetasizer软件处理数据以计算Z平均值。测量进行三次，结果以毫伏（mV）报告。
2.6 场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）与EDS
使用双束场发射扫描电子显微镜在二次电子成像模式下检查微颗粒的表面形态。成像前，样品储存在干燥器中，用碳胶带安装在铝桩上，并使用溅射镀膜机镀上6纳米厚的铂层。使用5 kV电子束进行成像。通过集成在FE-SEM上的EDS在20 kV下分析表面元素组成。绘制样品不同区域的元素分布图，并使用Aztec软件识别和量化元素。
2.7 统计分析
使用Design-Expert软件中的部分因子设计来生成模型运行并研究结果。将体积加权平均微颗粒尺寸（PS）和Zeta电位（ZP）设定为统计研究的响应变量。使用模型诊断（如半正态图、帕累托图和方差分析）来评估对体积加权平均微颗粒尺寸和Zeta电位有主要影响的独立工艺参数的显著性。
3 结果与讨论
3.1 IGVJFT操作
本研究是前期研究工作的延续，前期工作调查了DDGS-高粱醇溶蛋白的物理化学性质，并将其与原粮高粱醇溶蛋白进行了比较。研究结果表明，由于用于生产生物燃料的高热处理，DDGS-高粱醇溶蛋白的蛋白二级结构发生了改变，特别是一些α螺旋的展开，随后重新排列成β折叠结构。这种结构改变有助于提高溶解性，并形成具有内部孔洞的不规则表面形态，这与在水-乙醇中原粮高粱醇溶蛋白所见的有序自组装形态形成对比。原粮高粱醇溶蛋白的自发组装依赖于内在的分子相互作用，而不需要外部刺激。较大颗粒的形成可能是由于生物乙醇生产过程中热诱导的二硫键破坏，这可能促进了多肽重新结合成紧密的微聚集体。
鉴于这些结构变化，本研究采用射流技术，辅以凝胶浴，来组装DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒。在药物开发与研究实验室，已提出大量使用射流技术制备生物材料的成功药理学方法。然而，关于需要二元溶剂（例如溶解于水-醇混合物的DDGS-高粱醇溶蛋白）的生物材料制备的文献较少。正确理解DDGS-高粱醇溶蛋白的胶体行为对于高效生产颗粒至关重要。因此，本研究结合了该技术的制剂和工程工艺参数，以深入了解DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒的制备。
本研究采用表中所列的选定参数水平（基于初步研究）来制备DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒。这些选定的参数产生了高度带电且无聚集的颗粒束。本实验设计方法通过16个运行（25?1）研究了五个独立工艺参数，其中“5”代表在两个水平上检查的独立工艺参数数量，“1”代表为制备DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒而选择用于分式设计的独立设计生成元数量。这五个参数是喷嘴直径、DDGS-高粱醇溶蛋白浓度、集成电极电压、内部频率和凝胶液浓度，评估了它们对DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒体积加权平均粒径和Zeta电位的影响。
3.2 DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒的体积加权平均粒径
所有实验运行产生的颗粒均在微米范围内，尺寸从967 ± 59 μm 到 522 ± 12 μm，平均值为748 ± 14。第8次运行（591 ± 18 μm）和第12次运行（522 ± 12 μm）产生了较小尺寸的DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒。通过方差分析对实验结果进行分析表明，与体积加权平均粒径相关的重要工艺参数依次为：高粱醇溶蛋白浓度 > 喷嘴直径 > 集成电极电压。离子凝胶化和振动射流技术产生的DDGS-高粱醇溶蛋白颗粒尺寸的这些变化可能会影响微颗粒的功能行为。例如，较小的颗粒通常水合更快，允许包埋化合物更快地扩散，而较大的颗粒往往保水更慢，可能支持更持久的释放行为。
根据方差分析结果，DDGS-高粱醇溶蛋白浓度是影响微颗粒尺寸的最显著工艺参数。随着高粱醇溶蛋白浓度的增加，微颗粒尺寸增大，这与较高的分散粘度和更强的分子间相互作用一致。例如，在2%（w/v）浓度下，运行2（937 μm）和运行11（967 μm）可能表现出高粱醇溶蛋白液滴对射流破碎的更大阻力，这反过来可能有利于形成大尺寸液滴。相比之下，1%的制剂持续产生更小的颗粒，表明射流破碎更精细。
喷嘴直径的影响基于单位体积的颗粒数量。这表明较大的喷嘴直径产生了具有更大横截面积的射流，这是后续液滴形成的关键参数。如图所示，喷嘴直径产生了显著效应，较大的喷嘴直径由于射流横截面积增加而产生更大的液滴。文献中已充分证实，较大的喷嘴会产生曲率减小的更宽层流射流，这可能导致液滴表面形成小扰动。因此，这往往有利于制备体积较大的颗粒。此外，集成电极电压对体积加权平均粒径具有统计学显著的主效应，诊断图表明，随着电压增加，颗粒尺寸呈下降趋势。
通过IGVJFT制备的DDGS-高粱醇溶蛋白的体积加权平均粒径结果与玉米醇溶蛋白颗粒文献一致，其中使用正交设计OA16（45）通过超声辅助透析技术组装醇溶蛋白玉米醇溶蛋白。值得注意的是，内部频率虽然是液滴均匀性的核心，但在所检查的900–1600 Hz范围内并未显著调节颗粒尺寸。这表明DDGS-高粱醇溶蛋白的分散行为可能归因于其强交联和疏水性，这可能削弱了在所检查范围内的振动扰动影响。
醇溶蛋白（玉米醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白）已证明能够在水性醇中形成球形颗粒。这意味着无序的高粱醇溶蛋白可以在没有外部指导的情况下转变为有组织的结构，而是依赖于弱内部相互作用，如范德华力、毛细管作用和氢键。高粱醇溶蛋白的自组装基于蒸发诱导机制，该机制涉及两种或多种溶剂，其中一种溶剂蒸发更快。结果，溶液的极性发生变化，从而驱动溶质的自组装。由于结构转变，DDGS-高粱醇溶蛋白通过溶剂诱导技术形成较大且形状较少的聚集体。本实验研究利用IGVJFT制备颗粒。整个过程包括三个步骤：（a）制备DDGS-高粱醇溶蛋白制剂；（b）通过在特定内部频率/振动下由电极电压产生的静电电荷，对蛋白质/海藻酸盐分散体表面累积电荷，从而将层流液体射流破碎成颗粒；（c）当这种高度带电的层流射流颗粒束与凝胶溶液接触时，发生聚合。
3.3 微颗粒的Zeta电位
Zeta电位是评估颗粒表面电荷大小并指示颗粒抗聚集潜在稳定性的物理化学参数。测定了所有实验运行的Zeta电位值。DDGS-高粱醇溶蛋白胶体悬浮液的Zeta电位值为+15.8 ± 0.5 mV。然而，与先前研究相比，DDGS-高粱醇溶蛋白的Zeta电位正值低于玉米醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白。这种较低的正电荷可能是由于蒸馏过程中的热诱导结构转变所致，该转变已显示α螺旋展开随后重新排列和重组为β折叠。
DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒的Zeta电位值范围在-32.8 ± 0.9 mV 到 -12.3 ± 0.7 mV之间。Zeta电位范围提供了对高粱醇溶蛋白微颗粒静电稳定性的洞察，其中表面电荷产生排斥力，而不是对应的范德华吸引力，从而防止颗粒聚集。尽管DDGS-高粱醇溶蛋白分散体显示出正Zeta电位，但使用射流技术辅以CaCl2制备的微颗粒在水中重新分散时表现出净负值。高粱醇溶蛋白是一种高度疏水的蛋白质，在水中水合有限。将DDGS-高粱醇溶蛋白悬浮在水中时，只有最外层表面被水合，这可能将酸性残基埋藏在聚集的蛋白质结构域内。因此，表面由中性或弱阳离子基团主导，这可能导致正Zeta电位。IGVJFT产生液滴，这些液滴在经受剪切、振动和Ca2+诱导聚集的同时固化。在此从液滴到固体颗粒形成的微颗粒生产过程中，高粱醇溶蛋白的一些疏水区域可能堆积到颗粒内部，而一些极性和可电离残基可能迁移到表面。这种重新排列可能导致谷氨酸和天冬氨酸残基暴露在颗粒表面。因此，当使用IGVJFT制备的DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒重新悬浮在水中进行Zeta电位测量时，暴露的酸性残基在水的近中性pH下被去质子化，这可能导致在滑移平面上产生带负电荷的羧酸盐基团。
此外，这表明制剂系统的总体负电荷（阴离子基团）显著高于正电荷（阳离子基团），随后导致净负电荷。方差分析数据表明Zeta电位工艺参数的显著性顺序如下：DDGS-高粱醇溶蛋白浓度 > 喷嘴直径 > 内部频率。显然，较低的DDGS-高粱醇溶蛋白浓度导致更大的离子排斥力（更负的Zeta电位）。颗粒的稳定性是吸引力和排斥力之间的平衡；也就是说，当排斥力（更高的负值）强于吸引力时，DDGS-高粱醇溶蛋白胶体系统将更稳定。更负的Zeta电位是由空间排斥或静电相互作用产生的，这些相互作用通过降低范德华力来影响颗粒的稳定性。总体而言，研究表明，液滴内较高的DDGS-高粱醇溶蛋白密度可能增强了分子间相互作用，如疏水相互作用和二硫键介导的交联，这些相互作用可能减少表面取向可电离基团的可用性。因此，由较高水平的DDGS-高粱醇溶蛋白浓度制备的颗粒带有较低的净负电荷。
喷嘴直径也显示出对Zeta电位的影响，可能是因为较大的喷嘴直径产生了更厚的液滴，这可能具有较低的喷射点剪切力。这种在液滴破碎过程中界面剪切驱动重排的程度较低，可能影响了颗粒表面更多带电残基的取向和暴露。从诊断图可以明显看出，喷嘴直径的增加增加了系统的Zeta电位。另一种可能的解释是，较慢的射流破碎促进了更致密表面的形成，其中埋藏的残基对表面电荷的贡献较小。
虽然内部频率的影响低于其他参数，但它仍然具有统计学显著性。数据表明，将频率从900 Hz增加到1600 Hz可能对射流引入了更强的周期性扰动，从而提高了颗粒破碎的效率。与此一致，在1600 Hz下生产的微颗粒表现出比在900 Hz下形成的颗粒更负的Zeta电位。可能的解释是，较高水平的内部振动可能减少了颗粒生产过程中的蛋白质-蛋白质相互作用，这可能允许更多去质子化的羧基保留在颗粒界面暴露。
电极电压的影响可能与液滴界面的电流体动力学环境有关。增加施加的电压增强了界面极化和电应力，这可以改变形成中的液滴与周围CaCl2溶液之间的电荷分布，从而影响微颗粒的最终表面电荷。实际上，电压没有超过Bonferroni显著性阈值；然而，数据显示出一致的趋势。例如，在集成电压为600 V下处理的许多颗粒制剂显示出比在类似其他条件下200 V的制剂稍负的Zeta电位。这种转变表明，施加的电场通过液滴表面的部分重排影响离子凝胶化过程中的界面电荷组织。总体而言，虽然影响幅度很小，但测量值表明至少颗粒表面存在电压依赖性变化。
3.4 微颗粒表面形态与元素组成
在较低分辨率（500 μm）下的场发射扫描电子显微镜显微照片揭示了选定运行批次之间微颗粒形态的差异。从运行2和运行11中观察到近似椭圆形的DDGS-高粱醇溶蛋白基微颗粒，而运行8和运行12产生了近似球形的DDGS-高粱醇溶蛋白基微球。这些发现与之前关于玉米醇溶蛋白的文献一致，其中作者报道较高的玉米醇溶蛋白浓度导致结构变形的微颗粒。这种行为可归因于较高浓度的醇溶蛋白导致粘度增加和分子间相互作用增强，这可能限制液滴固化过程中的分子迁移率。当溶剂扩散出来时，受限的链重排可能促进内部空隙的形成，从而导致变形。
在更高放大倍数（50 μm）下也解析了微颗粒的表面纹理。DDGS-高粱醇溶蛋白基微颗粒（运行2和11，以及运行8和12）显示出非均匀的表面纹理。尽管如此，与运行8和12相比，在运行2和11的微颗粒中观察到的微相裂纹较少。这些裂纹是具有两亲性表面的蛋白质微颗粒的特征，包括玉米醇溶蛋白，当胶体分散体高度致密时。这些发现与之前的研究相似，其中一项研究报告称，玉米醇溶蛋白浓度的增加导致具有不均匀形态的大颗粒。
能量色散X射线光谱显示，在运行11（大尺寸）DDGS-高粱醇溶蛋白基微颗粒表面存在C、N、O、Cl和Ca元素。运行12（小尺寸球形）DDGS-高粱醇溶蛋白基微颗粒的元素谱显示表面存在C、O、Na、S、Cl和Ca。研究结果表明，浓度依赖性产生的形态影响颗粒的表面元素组成。例如，在较高DDGS-高粱醇溶蛋白浓度下生产的运行11产生了更致密的结构，而在较低DDGS-高粱醇溶蛋白浓度下制备的运行12颗粒显示出更开放的结构。尽管高粱醇溶蛋白含有含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸），但它们是否能被能量色散X射线光谱检测到取决于这些残基是否暴露在最外层片段，即1-2 μm（这是能量色散X射线光谱的最大穿透深度）。在运行11中，未检测到S表明富含半胱氨酸的结构域埋藏在内部，这与从扫描电子显微镜成像中明显看出的这些较大颗粒的更致密、更紧凑的形态一致。相反，S出现在运行12中，这表明较低的高粱醇溶蛋白浓度和更疏松的结构导致含硫残基在表面有更大的暴露。
颗粒表面存在Ca和Cl表明当液滴进入CaCl2凝胶浴时发生交联。这些离子提供了颗粒刚性，并抵抗在水性介质中快速崩解。在运行12中检测到Na可能是由于提取试剂（NaOH和Na2S2O5）中残留的钠，这也可能反映了在更多孔、低浓度的颗粒中亲水或可电离片段有稍高的暴露。综上所述，元素谱表明，较高DDGS-高粱醇溶蛋白浓度的制剂产生了较大的颗粒，这些颗粒倾向于埋藏富含硫和氮的区域，而制备较小DDGS-高粱醇溶蛋白颗粒的加工条件增加了硫和氮富集基团在界面的暴露。此外，在表面检测到Ca和Cl进一步支持了对Zeta电位结果的解释，因为这些离子预计会与去质子化的羧基相互作用，并影响制剂微颗粒的总体静电势。
此外，先前研究已显示C、O、S和N元素存在于玉米醇溶蛋白表面，其水接触角为126°，其他看到的元素表明一些表面片段由那些属于元素周期表左下角的元素组成。通过能量色散X射线光谱对表面元素谱进行绝对测量是困难的，因为X射线只能非常少地穿透到颗粒内部，但不超过2微米。然而，能量色散X射线光谱已常规用于生物材料的表面元素分析，包括玉米醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白。因此，能量色散X射线光谱数据表明，IGVJFT的工艺参数，包括DDGS-高粱醇溶蛋白浓度，可以调控所制备微颗粒的形态和化学性质，从而影响其水合行为、机械完整性以及作为递送载体的能力。
4 结论
本研究采用部分因子设计，旨在确定影响DDGS-高粱醇溶蛋白微颗粒体积加权平均粒径和Zeta电位的IGVJFT关键工艺参数。部分因子设计表明，DDGS-高粱醇溶蛋白浓度、喷嘴直径、集成电压和内部频率是
