《Food Science & Nutrition》：Genome-Wide Identification and Expression Analysis of Pathogenesis-Related Protein 1 in Sweet Potato and Its Two Relatives
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本文首次在六倍体甘薯（Ipomoea batatas）及其二倍体近缘野生种三裂叶薯（I. triloba）和I.trifida中系统鉴定了119个病程相关蛋白1（PR1）基因，揭示了其进化特征、顺式作用元件与表达模式。研究发现，关键基因IbPR1-5在真菌侵染与干旱胁迫下持续上调，为甘薯抗性分子育种提供了重要的候选基因。
引言
作为固着生物，植物在其生命周期中会暴露于多种环境胁迫，这些胁迫可分为生物胁迫（如病原体入侵）和非生物胁迫（如干旱、盐碱）。为了应对这些挑战，植物进化出了复杂的先天免疫系统和胁迫响应机制。病程相关（PR）蛋白是介导这些防御和胁迫适应过程的关键分子群，其中病程相关蛋白1（PR1）是植物先天免疫的核心组成部分，并在系统获得性抗性（SAR）中作为分子标记。PR1蛋白属于CAP（富含半胱氨酸的分泌蛋白、抗原5和病程相关蛋白1）超家族，其CAP结构域对于抵抗生物和非生物胁迫的生理功能至关重要。尽管PR1基因在多种植物中已被研究，但在甘薯及其近缘种中的信息有限。本研究旨在对甘薯及其两个二倍体野生近缘种（I. trifida和I. triloba）的PR1基因家族进行全基因组鉴定和比较分析，以阐明其进化动态和胁迫响应功能。
材料与方法
研究从Ipomoea Genome Hub和甘薯基因组资源网站下载了三个物种的基因组信息和注释文件。采用BLASTP搜索、HMMER隐马尔可夫模型筛选（使用Pfam数据库的CAP结构域模型PF00188）以及SMART和CD-search验证相结合的策略，全面鉴定PR1家族成员。利用ExPASy在线工具分析预测蛋白的理化性质，并通过SWISS-MODEL预测三维结构。使用TBtools-II软件将鉴定到的基因定位到染色体上并可视化。为探究系统发育关系，从TAIR数据库下载了拟南芥（A. thaliana）的22个PR1蛋白序列，与三个甘薯属物种的PR1氨基酸序列一起，通过ClustalW比对，并使用MEGA 10软件以邻接法（NJ）构建系统发育树（1000次自举重复）。利用MEME套件分析PR1蛋白的保守基序，并从GFF3文件中提取基因的外显子-内含子结构。通过PlantCARE数据库预测PR1基因起始密码子上游2000 bp启动子区的顺式作用元件。使用TBtools软件的MCScanX功能进行物种内和物种间的共线性分析，并计算同源基因对的Ka/Ks（非同义替换率/同义替换率）比值以评估进化选择压力。表达分析方面，从NCBI获取了镰刀菌（F. solani）感染的RNA-seq数据，并从实验室相关研究中获取了甘薯黑斑病菌（C. fimbriata）侵染和干旱胁迫（10% PEG6000模拟）的转录组数据。对于两个野生种，从公共数据库（GT4SP Data Download）获取了不同组织以及冷、热、干旱、盐和激素处理下的表达数据（FPKM值）。通过qRT-PCR对甘薯中部分PR1基因在干旱胁迫下的表达进行了验证，以GAPDH为内参基因，采用2???Ct法计算相对表达量。
结果
3.1 三个甘薯属物种中PR1基因的鉴定
通过多策略联合鉴定，在栽培甘薯（I. batatas）及其两个二倍体野生近缘种中，共鉴定出119个PR1或PR1-like基因，其中甘薯33个（命名为IbPR1-1至IbPR1-33）、I. trifida50个（ItfPR1-1至ItfPR1-50）、I. triloba36个（ItbPR1-1至ItbPR1-36）。这些基因的CDS长度、编码蛋白的分子量（MW）和等电点（pI）等理化性质存在较大变异。所有PR1蛋白的不稳定性指数均大于40，属于不稳定蛋白，且大多数为亲水性蛋白。染色体定位分析显示，这些PR1基因在三个物种的染色体上分布不均。例如，在甘薯中，多达8个IbPR1s位于9号染色体上；而在I. triloba中，12个基因位于1号染色体上。
3.2 甘薯及其两个二倍体野生近缘种中PR1基因的系统发育关系分析
基于甘薯属物种和拟南芥PR1蛋白序列构建的系统发育树，将141个PR1蛋白划分为5个组。其中第5组最大（含65个蛋白），第1组最小（8个蛋白）。拟南芥的PR1成员分布在1、3、4组，而第2组和第5组是甘薯属特有的进化枝，可能与其在适应特定生境过程中的功能分化有关。
3.3 甘薯属PR1基因的保守结构域和基因结构
保守基序分析鉴定出15个基序，其中基序-2（含类固醇结合的CBM结构域）存在于所有119个甘薯属PR1蛋白中，最为保守。绝大多数成员含有完整的CAP1-4结构域，但部分成员（如IbPR1-6、ItfPR1-12等）存在结构域缺失，更适宜被称为PR1-like蛋白。基因结构分析发现，约70%的甘薯属PR1基因（119个中的93个）仅含1个外显子且无内含子，这可能有助于其快速响应胁迫。值得注意的是，IbPR1-30拥有16个外显子，且除了CAP结构域外还含有其他7个结构域，提示其可能具有多重功能。
3.4 三个甘薯属物种基因组中PR1基因的共线性分析
物种内共线性分析显示，甘薯、I. trifida和I. triloba中分别存在4对、0对和2对同源基因对。物种间共线性分析则鉴定出44对直系同源基因对，其中甘薯与I. trifida之间的直系同源基因对最多（17对），表明两者亲缘关系更近。与拟南芥、大豆、番茄的共线性分析也表明PR1基因在不同物种间具有一定保守性。
3.5 甘薯属PR1基因重复与共线基因对的Ka/Ks分析
对同源基因对的Ka/Ks分析表明，92.2%的基因对的Ka/Ks比值小于1，说明它们在进化过程中主要经历了纯化选择。仅有少数基因对（如甘薯中的IbPR1-3/IbPR1-4，Ka/Ks=1.12）的比值大于1，表明它们可能经历了正选择。
3.6 甘薯及其两个二倍体野生近缘种PR1基因启动子区顺式作用元件分析
对启动子区顺式作用元件的预测发现，光响应元件最为丰富（占49.4%）。此外，还鉴定到大量激素响应元件，如茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、赤霉素、生长素和水杨酸（SA）响应元件，表明PR1基因参与了植物激素介导的调控网络。同时，也检测到与厌氧诱导、干旱诱导、低温响应、防御和胁迫响应相关的元件。这些结果共同表明PR1基因与植物的生长发育以及对生物和非生物胁迫的响应密切相关。
3.7 甘薯及其两个二倍体野生近缘种中PR1基因的表达模式
3.7.1 I. trifida和I. triloba中PR1基因的表达分析
组织特异性表达谱显示，两个野生种中大部分PR1基因在花或花蕾中高表达，暗示其在生殖发育过程中的潜在作用。在非生物胁迫和激素处理下，许多PR1基因的表达下调。例如，在冷、热、干旱和盐胁迫下，ItbPR1-15均下调表达；在IAA、ABA和GA处理下，ItfPR1-32和ItbPR1-35（一对直系同源基因）也表现出一致的下调模式。
3.7.2 甘薯中PR1基因的表达分析
分析了甘薯在镰刀菌、甘薯黑斑病菌侵染和干旱胁迫下的转录组数据。在镰刀菌处理下，仅IbPR1-5、IbPR1-23和IbPR1-28上调表达。在甘薯黑斑病菌侵染抗病品种NJ92和感病品种YT252后，多个IbPR1基因（如IbPR1-5、IbPR1-7、IbPR1-28）的表达随侵染时间延长而上调，且在抗病品种中的响应更显著。在干旱胁迫下，IbPR1基因的表达呈现组织特异性：在叶片中，IbPR1-1和IbPR1-5上调；在根中，仅IbPR1-15上调，而包括IbPR1-1和IbPR1-5在内的多个基因下调。qRT-PCR结果验证了转录组数据的可靠性。综合来看，IbPR1-5在三种测试的胁迫处理下均表现出一致的上调表达模式，且与拟南芥中功能已知的PR1同源物（AT2G14610）位于同一系统发育分支（第4组），使其成为甘薯抗逆分子育种中一个极具潜力的候选基因。
讨论
本研究首次在甘薯及其野生近缘种中系统鉴定了PR1基因家族。与许多物种中PR1基因数量随倍性增加而扩张的趋势不同，二倍体的I. trifida比六倍体的甘薯拥有更多的PR1基因，这可能源于物种特异的基因扩张或甘薯多倍化过程中的基因丢失。大部分PR1基因的无内含子结构可能利于其快速转录响应胁迫。系统发育分析揭示了甘薯属特异的进化枝（第2、5组），可能与生境适应相关。共线性和Ka/Ks分析表明，PR1基因在进化中主要受纯化选择主导，但少数基因经历了正选择，这可能促进了功能特化。启动子分析揭示了PR1基因参与光、激素和多种胁迫响应的复杂调控网络。表达谱分析证实了PR1基因在野生种花器官发育中的可能作用，以及在胁迫响应中的功能多样性。在甘薯中，IbPR1-5展现出对生物和非生物胁迫的广谱上调响应，凸显了其应用价值。同时，许多PR1基因在测试条件下表达量低或无响应，这可能是因为它们对未测试的胁迫（如重金属、UV、其他病原体）或组合胁迫特异响应，亦或其功能主要发生在翻译或分泌水平而非转录水平。
结论
本研究在甘薯（I. batatas）及其野生近缘种I. trifida和I. triloba中鉴定出119个PR1基因，并对其进行了全面的生物信息学和表达模式分析。染色体分布不均，系统发育分为五组，揭示了进化保守性与潜在功能分化。保守结构域分析明确了典型PR1与PR1-like蛋白的差异。基因结构以单外显子为主，利于快速响应。共线性与Ka/Ks分析表明进化以纯化选择为主。启动子富含光、激素及胁迫响应元件。表达分析表明野生种PR1基因在花中高表达并响应胁迫/激素；在甘薯中，IbPR1-5在多种胁迫下持续上调，而干旱响应具有组织特异性。这些结果阐明了甘薯属PR1基因的特征，并确立了IbPR1-5作为甘薯抗逆性遗传改良的关键候选基因。
