《Food Science & Nutrition》：Screening and Identification of Triglyceride-Lowering Lactic Acid Bacteria and Preparation of Probiotic Agents
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本研究从贵州传统发酵食品中分离、筛选出具有显著甘油三酯（TG）降解能力的乳酸菌（LAB），并成功开发了稳定的益生菌片剂。筛选出的六株LAB甘油三酯降解率均超过60%，其中PYC02（发酵粘液乳杆菌）和PLHB02（食窦魏斯氏菌）降解率超过80%，且在pH 3.0和0.3%胆盐条件下存活率高于80%，展现出优异的胃肠耐受性与安全性。通过正交实验优化，确定了最佳冻干保护剂配方（8%脱脂乳粉、5%海藻酸钠、2%麦芽糊精、8%海藻糖），所制益生菌片剂在4°C和25°C储存30天后存活率分别超过80%和60%，甘油三酯降解率仍大于60%，片剂性能符合《中国药典》（2020年版）相关标准。本研究为开发用于高甘油三酯血症（hypertriglyceridemia）预防与治疗的功能性益生菌产品提供了新策略。
引言：高甘油三酯血症与非药物干预新策略
随着全球肥胖与代谢性疾病流行，高脂血症已成为重大健康威胁。其中，甘油三酯（TG）是脂质代谢的关键生物标志物，其水平升高与动脉粥样硬化、冠心病、2型糖尿病等疾病密切相关。药物治疗虽可一定程度控制甘油三酯水平，但难以从根本上调节脂质代谢，且长期使用可能伴随肝酶升高、肾毒性和肌毒性等副作用。因此，开发安全有效的非药物干预手段成为当前研究重点。
乳酸菌（LAB）作为益生菌的关键代表，已被证实可通过抑制脂肪吸收、增强脂质代谢活性、调节肠道菌群平衡等多种机制降低血脂水平。近年来，具有降解甘油三酯能力的益生菌研究显著增加，但从发酵食品中筛选高效菌株并开发成益生菌剂的研究仍有限。本研究旨在从贵州传统发酵食品中筛选具有强效降甘油三酯能力的LAB菌株，并开发相应的益生菌制剂，为新型功能性益生菌产品的开发提供科学依据。
材料与方法：从筛选到制剂的全流程
菌株来源与筛选：实验菌株分离自贵州传统发酵食品，包括自制泡萝卜、泡竹笋、泡白菜，以及市售盐菜、腐乳、泡菜、什锦泡菜、酸汤等，此外还包括从校园水果店购买后发酵分离的发酵猕猴桃和柿子。通过含碳酸钙的MRS琼脂培养基，从26株分离菌株中初筛。将菌株接种于含甘油三酯的MRS液体培养基中培养48小时，使用甘油三酯测定试剂盒测量无细胞上清液中的甘油三酯含量，计算降解率。
菌株鉴定与耐受性测试：对筛选出的六株LAB进行形态学观察、革兰氏染色，并外包进行16S rRNA基因测序，通过NCBI BLAST比对和MEGA 11构建系统发育树进行分子鉴定。通过将菌株接种于pH 3.0的MRS肉汤和含0.3%胆盐的培养基中，分别培养1、2、4小时后进行平板计数，评估其酸和胆盐耐受性，计算存活率。
安全性评估：通过哥伦比亚血琼脂平板培养48小时，观察溶血圈，评估菌株的溶血活性（α-、β-或γ-溶血）。使用安普霉素、氨苄青霉素、甲氧苄啶和卡那霉素四种抗生素，通过抑菌圈直径判断菌株的抗生素敏感性（敏感：>20 mm；中度耐药：15–19 mm；耐药：≤14 mm）。
益生菌片剂的制备与优化：以5%（w/v）脱脂乳粉为冻干保护剂基质，分别添加不同浓度的脱脂乳粉（4%, 8%, 12%, 16%）、海藻酸钠（1%, 3%, 5%, 7%）、麦芽糊精（1%, 2%, 3%, 4%）和海藻糖（2%, 4%, 6%, 8%）进行单因素实验，确定各保护剂的最佳浓度范围。在此基础上，以脱脂乳粉（A）、海藻酸钠（B）、麦芽糊精（C）、海藻糖（D）的浓度为因素，设计L9(34)正交实验，优化冻干保护剂配方，以最大化益生菌冻干存活率。
益生菌片剂的处方包含活性成分（40%益生菌菌粉）、辅料（20%玉米淀粉、30%阿拉伯糖/麦芽糊精混合物[2:1]、9%甘露醇）、1%润滑剂、0.3%食品添加剂及适量粘合剂等。将活化后的菌液离心收集菌体，用无菌水重悬，添加优化后的冻干保护剂，经-80°C预冻24小时后冷冻干燥制得菌粉，过120目筛后按处方制备片剂。
片剂性能与活性评价：按照《中国药典》（2020年版）通则0101、0923和0921，分别对片剂进行重量差异、脆碎度和崩解时限检查。将制备好的益生菌片剂用无菌水系列稀释后涂布于MRS琼脂平板，培养后挑取单菌落进行三次传代培养，随后转移至MRS-甘油三酯液体培养基，培养后离心收集菌体，按试剂盒操作测量OD500 nm值，计算片剂的甘油三酯降解率。将密封的片剂分别置于4°C和25°C储存，在第10、20、30天随机取样测定活菌数，计算储存期间活菌的存活率。
结果与讨论：高效、耐受且安全的降脂益生菌
甘油三酯降解能力筛选：从26株LAB中筛选出六株甘油三酯降解率超过60%的菌株。菌株MHT02、SC03、SZ02、PYC02、PLHB02和SS01的降解率分别为67.69% ± 0.77%、64.98% ± 0.38%、80.26% ± 0.44%、84.87% ± 0.45%、87.95% ± 0.45%和65.64% ± 1.18%。其中，SZ02、PYC02和PLHB02的降解能力最强，均超过80%。相较于文献中报道的鼠李糖乳杆菌R4（28.92%）和乳杆菌BH6（18.97%），本研究的PYC02和PLHB02展现出更优的降脂潜力。
菌株鉴定：六株降脂能力最强的LAB在含碳酸钙的琼脂上均能形成溶钙圈，表明产酸能力强。菌落呈乳白色，表面光滑湿润，中心凸起。革兰氏染色镜检显示均为紫色杆状菌，包括短杆和长杆形态。
16S rRNA基因测序与同源性比对结果显示，PLHB02和SZ02与食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）同源性达99.80%；PYC02、MHT02、SS01和SC03与发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）同源性超过99.73%。系统发育树结果进一步确认了其分类地位。
酸与胆盐耐受性：在pH 3.0条件下处理4小时，除MHT02外，其余菌株存活率均超过80%，其中SS01、PYC02和PLHB02耐受性最强，4小时存活率分别为86.07% ± 0.85%、88.67% ± 0.67%和89.57% ± 0.64%。在0.3%胆盐条件下处理4小时，所有菌株存活率均高于73.17%，其中PYC02、PLHB02和SZ02耐受性尤佳，4小时存活率仍保持在80%以上。这些结果表明PYC02和PLHB02对人体的胃肠环境（胃酸pH 2.0-3.0，肠道胆盐浓度0.03%-0.3%）具有出色的适应能力。
安全性评估：溶血试验显示，六株菌在哥伦比亚血琼脂平板上均未产生溶血圈，表现为γ-溶血（无溶血活性），表明其不产生能溶解红细胞的酶或毒素，安全性较高。
抗生素敏感性测试显示，六株菌对安普霉素、氨苄青霉素、甲氧苄啶和卡那霉素的抑菌圈直径在19.4至25.7 mm之间，均表现为敏感（S），表明其抗生素耐药性水平低，安全性能良好。
冻干保护剂优化与片剂制备：单因素实验确定，脱脂乳粉、海藻酸钠、麦芽糊精和海藻糖的最佳浓度分别为8%、5%、2%和4%时，益生菌存活率出现峰值。正交实验优化得到的最佳保护剂组合为A1B3C2D3，即8%脱脂乳粉、5%海藻酸钠、2%麦芽糊精、8%海藻糖，此条件下LAB冻干存活率最高，达84.7%。
片剂性能评价：采用湿法制粒制备的益生菌片剂平均片重0.24 g，重量差异符合规定；脆碎度为0.52%；平均崩解时间为7.68分钟。所有指标均满足《中国药典》（2020年版）的相关要求。
益生菌片剂的活性与稳定性
甘油三酯降解能力：由PYC02、PLHB02、SS01和SZ02制备的益生菌片剂均保有降解甘油三酯的能力。其中，PYC02和PLHB02片剂的降解能力最强，降解率分别为64.80% ± 2.52%和66.93% ± 2.01%，显著高于另外两种片剂。文献提示，乳酸菌可能通过分泌脂肪酶（Lipase）直接水解甘油三酯，或通过调节肠道菌群、产生短链脂肪酸（SCFAs）、影响肝脏甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）和烯酰-CoA异构酶等脂代谢相关酶的表达，以及促进肝脏胆汁酸分泌等多种途径，间接降低甘油三酯水平。
储存温度对活性的影响：片剂在4°C和25°C下储存30天后，活菌存活率均有所下降，但4°C下的存活率显著高于25°C。储存30天后，四个菌株片剂在4°C下的存活率均超过80%，而在25°C下，PYC02和PLHB02片剂的存活率仍能保持在60.93% ± 0.25%和63.10% ± 0.60%。结果表明，4°C低温储存更有利于保持益生菌片剂的活性和稳定性。
结论与展望
本研究成功从贵州传统发酵食品中筛选并鉴定了六株具有显著甘油三酯降解能力的乳酸菌。其中，PYC02（发酵粘液乳杆菌）和PLHB02（食窦魏斯氏菌）降解能力突出（>80%），且具备优异的胃肠应激耐受性（酸、胆盐）和良好的安全性（无溶血、抗生素敏感）。通过优化冻干保护剂配方，制备出的益生菌片剂性能符合药典标准，并在储存期内保持了较高的活菌存活率与甘油三酯降解活性。这些发现凸显了该六株乳酸菌在降低甘油三酯方面的巨大潜力，为后续开发用于预防和治疗高甘油三酯血症的新型功能性食品和膳食补充剂提供了坚实的科学依据和理论支撑。未来的研究可进一步通过基因组学、代谢组学分析结合动物实验，深入阐明PYC02和PLHB02降脂的具体分子机制，并验证其体内功效。
