基于AuNPs@2D Ni/Co-MOF与杂交链反应双信号放大的无酶比率电化学适配体传感器，用于双酚A的超灵敏检测

《Food Frontiers》：Enzyme-Free Ratiometric Electrochemical Aptasensor for Ultrasensitive Detection of Bisphenol A Based on Dual-Amplification of Highly Conductive AuNPs@2D Ni/Co-MOF and Hybridization Chain Reaction

本研究开发了一种基于双重信号放大策略的比率电化学适配体传感器，用于超灵敏检测双酚A（BPA）。传感器以兼具高负载位点和优异导电性的金纳米粒子/二维镍钴金属有机框架复合材料（AuNPs@2D Ni/Co-MOF）为信号增强平台，并引入无酶恒温杂交链反应（HCR）放大机制，构建了以二茂铁（Fc）和亚甲基蓝（MB）为信号对的比率检测体系，实现了对BPA超灵敏、高选择性检测，在食品安全监测中展现出应用潜力。

　　

1 引言

双酚A（BPA）是一种具有内分泌干扰特性的环境污染物，对食品安全和人类健康构成风险。传统的检测方法如高效液相色谱法（HPLC）存在操作复杂、设备昂贵等局限，因此发展快速、灵敏、便捷的检测方法势在必行。电化学传感器以其高灵敏度和低成本优势受到关注，但传统单信号传感器易受干扰。比率电化学传感器则能通过测量两个信号的比例来提高准确性和抗干扰能力。适配体作为一种可特异性识别靶标的单链DNA或RNA，是构建高选择性传感器的理想识别元件。

先进功能材料是提升电化学适配体传感器性能的关键。其中，二维（2D）金属有机框架（MOF）纳米片因其巨大的比表面积和可调结构而备受瞩目。然而，其电化学活性通常较弱，可通过双金属掺杂（如Ni/Co）和贵金属纳米粒子（如金纳米颗粒AuNPs）修饰来显著提升导电性和电催化性能。此外，杂交链反应（HCR）作为一种无酶的等温信号放大技术，可通过级联反应形成长双链DNA（dsDNA），为嵌入信号分子（如亚甲基蓝，MB）提供丰富的位点，实现信号的有效放大。

基于此，本研究构建了一种基于AuNPs@2D Ni/Co-MOF复合物和HCR双重信号放大技术的比率电化学适配体传感器，用于实现BPA的超灵敏、高选择性检测。

2 实验方法

2.1 HCR扩增与电化学检测

传感器构建流程如下：首先，将制备的AuNPs@Ni/Co-MOF纳米复合材料分散液滴涂在预处理好的玻碳电极（GCE）表面。接着，将巯基化单链DNA（SH-DNA）与二茂铁标记的BPA适配体（Fc-apt）孵育杂交，并将得到的双链SH-DNA@Fc-apt通过冷冻诱导自组装技术固定到电极表面的复合材料上。随后，用巯基己醇（MCH）封闭非特异性吸附位点。在目标物BPA存在时，Fc-apt会与其特异性结合并从电极表面解离。暴露出的SH-DNA可触发HCR反应，加入两种发夹探针H1和H2后，在电极表面形成长的dsDNA。最后，嵌入MB作为另一个电化学信号指示剂。利用差分脉冲伏安法（DPV）检测Fc和MB的电流信号比值，实现对BPA的定量分析。

3 结果与讨论

3.1 传感器构建原理

传感器工作原理如图1所示。AuNPs@Ni/Co MOF作为传感基底，其负载的AuNPs可提高导电性，而其2D结构提供了丰富的适配体固定位点。当不存在BPA时，Fc-apt与SH-DNA杂交，将Fc信号分子锚定在电极表面，此时Fc信号强。同时，SH-DNA被封闭，无法触发HCR，嵌入的MB信号弱。当存在BPA时，Fc-apt与BPA特异性结合并从电极上解离，导致Fc信号减弱。同时，被释放的SH-DNA可触发HCR反应，形成长的dsDNA结构，嵌入大量MB分子，从而使MB信号显著增强。通过测量I_MB/I_Fc的比值变化，可实现对抗原浓度的高灵敏、抗干扰检测。此外，研究中采用的冷冻诱导自组装技术有助于DNA在电极表面形成更均一、稳定的生物识别层，提升了传感器性能。

3.2 AuNPs@Ni/Co MOF复合材料的表征

通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察了材料的形貌。2D Ni/Co MOF呈现光滑但形状不一、分布不均的二维纳米片结构。修饰AuNPs后，纳米片表面变得粗糙，AuNPs均匀分布其上。TEM和EDS能谱进一步证实了AuNPs成功负载到2D Ni/Co MOF上。X射线衍射（XRD）图谱显示，复合材料保留了2D Ni/Co MOF的特征峰。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和Zeta电位分析也验证了材料的成功合成与复合。

3.3 传感策略的可行性验证

通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）验证了HCR反应的可行性。结果显示，在BPA存在时，SH-DNA暴露并触发HCR，形成长链dsDNA，而对照组则无此现象，证明了BPA适配体的高特异性。DPV测试表明，在加入BPA后，MB信号显著增强，而Fc信号减弱，验证了传感机制的可行性。此外，通过循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）对电极逐步修饰过程进行了表征。结果证实，AuNPs的引入改善了MOF的导电性，而DNA、MCH、HCR产物等生物分子的修饰会增大电子转移阻抗，MB的嵌入则降低了阻抗，这些变化与传感器构建过程的预期一致。

3.4 实验条件优化

对影响传感器性能的关键参数进行了优化，包括SH-DNA与Fc-apt的比例、BPA与适配体的孵育时间、HCR反应时间、MB反应时间以及缓冲液pH值。最终确定的最优条件为：SH-DNA:Fc-apt体积比为1:2，BPA孵育时间30分钟，HCR反应时间120分钟，MB反应时间25分钟，检测缓冲液pH为7.4。

3.5 传感器的电化学检测性能

在最优条件下，传感器对BPA表现出优异的检测性能。DPV曲线显示，随着BPA浓度（1 × 10^?17至 1 × 10^?11M）增加，I_Fc信号递减，I_MB信号递增。I_MB/I_Fc比值与BPA浓度的对数在1 × 10^?17至 1 × 10^?11M范围内呈现良好的线性关系，线性方程为I_MB/I_Fc= 0.227 Lg C_BPA+ 4.823 (R²= 0.997)。计算得出的检出限（LOD）低至9.25 × 10^?18M。与室温条件下组装的传感器相比，采用冷冻诱导组装技术可显著拓宽线性范围、提高线性相关系数并降低检出限，这归因于更稳定、均一的生物识别界面。该传感器性能优于多数已报道的BPA检测方法。

3.6 选择性与重现性

通过检测BPA及其结构类似物（如BPB、BPC、BPAF）评估了传感器的选择性。实验表明，即使结构类似物的浓度是BPA的100倍，也不会对BPA的检测产生明显干扰，证明了该适配体传感器对BPA具有优异的选择性和抗干扰能力。此外，通过对同一浓度BPA进行6次平行测试，计算得到相对标准偏差（RSD）为4.2%，表明传感器具有良好的重现性。

3.7 传感器的实际应用

为验证传感器的实际应用潜力，进行了加标回收实验。分别以自来水、牛奶和鸡肉为实际样品基质，加入不同浓度的BPA标准品。实验结果表明，传感器在水和牛奶样品中的加标回收率在99.69%至108.20%之间，RSD在1.3%至5.9%之间；在鸡肉样品中的回收率在93.28%至117.50%之间，RSD在5.7%至8.8%之间。这些数据表明，该比率电化学适配体传感器能够准确定量检测真实复杂样品中的痕量BPA。

4 结论

本研究成功构建了一种基于AuNPs@2D Ni/Co-MOF纳米复合材料和HCR双重信号放大的无酶比率电化学适配体传感器，用于BPA的超灵敏检测。AuNPs@2D Ni/Co-MOF作为高性能的信号增强与转导平台，其中2D结构提供了大量锚定位点，而AuNPs的引入显著提升了导电性。HCR作为一种高效的生物分子信号放大器，同时为信号标签MB提供了嵌入载体。结合冷冻诱导自组装技术，该传感器在电极表面形成了稳定、均一的生物识别界面。最终，传感器在1 × 10^?17至 1 × 10^?11M的宽浓度范围内表现出优异的线性响应，检测限低至9.25 × 10^?18M，并具有高选择性、良好的重现性和实际样品检测能力。该工作为构建高灵敏、操作便捷的比率电化学适配体传感器提供了新思路。