《Gene Therapy》：Spatial transcriptomics and single-nucleus RNA sequencing reveal rAAV2- and rAAV9-specific transduction signatures in the mouse liver
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本文利用前沿的空间转录组学技术和单核RNA测序，在小鼠模型中系统描绘了重组腺相关病毒(rAAV)载体rAAV2与rAAV9的肝脏转导特征。研究不仅精准定位了不同血清型载体在肝小叶分区的偏好性（rAAV2偏门户区，rAAV9偏中央区），还揭示了与转导相关的广泛转录组变化，涉及脂质代谢、生物钟、免疫/应激响应等关键通路，并发现了性别特异性的差异模式。此项概念验证性工作，为深入理解AAV载体生物学、优化肝靶向基因治疗策略提供了全新的空间多组学视角和有力的假说生成工具。
研究背景与方法
肝脏是重组腺相关病毒载体基因治疗的主要靶向或脱靶器官。肝脏由肝小叶构成，每个肝小叶进一步分为门静脉周围区、中间区和中央静脉周围区，各区域具有不同的代谢功能。既往研究表明，rAAV2载体倾向于转导门静脉周围区，而rAAV9偏爱中央静脉周围区，且雄性小鼠的肝脏转导效率通常更高。这些差异可能与雄激素调节通路、肝脏分区特异性代谢以及AAV受体/共受体表达的差异有关。为全面解析rAAV转导的空间分布及其引发的全基因组转录组变化，本研究结合了10x Genomics Visium空间转录组学与单核RNA测序技术，对经rAAV2-CMV-EGFP和rAAV9-CMV-EGFP载体处理的雄性和雌性小鼠肝脏进行了综合分析，并以PBS处理的动物作为对照。该研究旨在验证空间转录组学作为映射rAAV生物分布新方法的可行性，并深入探究与转导相关的分子特征。
空间转录组学精准绘制rAAV生物分布图
研究证实，10x Genomics Visium平台能够有效空间定位报告基因EGFP的表达。分析显示，rAAV9-CMV-EGFP处理的小鼠在中央静脉周围区EGFP表达更高，而rAAV2-CMV-EGFP则在门静脉周围区表达最高。与既往研究一致，rAAV9-CMV-EGFP的EGFP表达水平高于rAAV2-CMV-EGFP，且两种血清型在雄性小鼠中的表达均高于雌性。单核RNA测序、原位杂交和免疫组化结果均支持了这些空间、血清型及性别特异性的表达模式。通过使用已知的分区标记物，研究成功将肝组织划分为门静脉周围区、中间区和中央静脉周围区，并利用反卷积技术将单核RNA测序数据中注释的门静脉周围和中央静脉周围肝细胞映射到组织空间位置，验证了分区划分的准确性。
揭示rAAV2与rAAV9-CMV-EGFP处理肝脏的分区特异性转录组响应
通过整合空间转录组学和单核RNA测序数据，研究系统表征了经rAAV2-或rAAV9-CMV-EGFP处理与对照组相比，小鼠肝脏在分区、血清型和性别维度上的特异性转录组响应。分析发现了大量与脂质代谢、生物钟和免疫响应相关的差异表达基因，并利用计算工具推断了转录因子和通路活性，通过基因集富集分析探究了潜在的功能通路。
脂质代谢的改变具有分区独立性及部分性别特异性
研究发现，rAAV2-和rAAV9-CMV-EGFP处理与脂质代谢相关基因的改变相关，这些变化表现出部分性别特异性，但在整体上呈现血清型和分区独立性。例如，长链脂肪酸延伸酶Elovl3、参与磷脂合成的Chka、在脂肪酸合成中起作用的Irs2以及调节脂肪酸β氧化并具有抗病毒效应的Ppard，在雄性和雌性rAAV2-和rAAV9-CMV-EGFP处理小鼠的肝脏所有分区中均呈现下调趋势。而调节脂肪酸和胆固醇合成的关键转录因子Srebf1则在处理组雄性小鼠中普遍下调。其他基因如Tlcd4、Cpt2和Acot1则显示出性别特异性的表达模式。通路活性分析显示，与脂质代谢密切相关的雄激素通路在处理组雄性小鼠和rAAV9-CMV-EGFP处理的雌性小鼠中呈下调趋势。基因集富集分析进一步证实了脂肪酸分解代谢等过程在雄性中上调、在雌性中下调的性别特异性趋势。单核RNA测序数据在很大程度上验证了这些发现。
跨肝区分区调节昼夜节律
研究还发现了与rAAV相关的生物钟相关特征，这些变化总体上不依赖于分区和性别，且在rAAV2和rAAV9-CMV-EGFP处理中均存在。差异表达分析显示，生物钟调节因子Dbp和Tef在rAAV9-CMV-EGFP处理小鼠及rAAV2-CMV-EGFP处理的雄性小鼠中普遍上调。相反，生物钟核心元件Arntl和生物钟抑制因子Nfil3呈现下调趋势，而Nr1d1和Nr1d2则上调。转录因子活性预测提示Bmal1和Clock活性整体上调。基因集富集分析预测“节律行为”在处理组雄性和雌性动物中均被激活。这些结果表明rAAV-CMV-EGFP处理导致了生物钟通路的广泛调节。
以分区独立和部分性别特异性模式改变免疫响应相关基因
空间转录组学数据为rAAV2-和rAAV9-CMV-EGFP介导的肝细胞驱动的免疫调节和DNA复制相关基因的改变提供了证据。例如，与复制应激和免疫响应相关的Gadd45g在rAAV9处理的雄性小鼠中显著上调，而在雌性中显著下调。参与免疫调节的Irf2bp2和作为抗病毒免疫响应负调控因子的Rnf125在处理组动物中整体下调。相反，涉及激活NF-κB和MAPK通路的Ripk2以及抗病毒免疫响应负调控因子Id2在处理后上调。通路活性预测显示，低氧通路在雌性中显著下调，而EGFR和TGF-β通路在雄性和雌性中均呈现上调趋势。单核RNA测序数据显示了相似的趋势，并且这些基因主要在肝细胞中表达，与组织病理学中未观察到免疫细胞浸润的情况一致。
空间转录组学界定已知及潜在的新型rAAV进入因子
rAAV9和rAAV2在肝脏的分区相关分布和转导差异，可能与影响rAAV转导的受体、共受体等因子的空间表达差异有关。研究首先在对照组动物中检查了已知rAAV进入因子的分区分布和表达水平，发现仅已知的AAV2共受体Fgfr1在雄性门静脉区的表达高于雌性，这可能部分解释了rAAV2的门静脉偏好性和性别差异。
进一步，通过分析报告基因EGFP表达与膜相关基因及已知AAV受体的空间共定位，研究识别出与转导显著相关的基因。在rAAV9-CMV-EGFP处理的雄性和雌性小鼠中，均发现了编码层粘连蛋白受体（已知的rAAV2和rAAV9共受体）的基因Rpsa。在rAAV2-CMV-EGFP处理的雄性小鼠中，发现了硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Sdc1，这与HSPG作为AAV2受体的已知作用一致。此外，还识别出Dpp4、Slc22a1、Slco1b2、Nrp1、Kdr、Fcgrt等多种可能与病毒进入相关的膜蛋白基因。研究还发现了仅存在于特定性别-血清型组合中的共定位基因，例如rAAV9-CMV-EGFP处理雄性小鼠中的Slc19a2、Ncl、Cldn2等，以及rAAV2-CMV-EGFP处理动物中的Fbp1、Cdh1、Pigr等。单核RNA测序显示，大多数这些基因主要在肝细胞中表达。这些发现揭示了多个已知的以及潜在的新型因子，它们与rAAV在肝细胞中的转导存在空间关联，为解释血清型和性别特异性模式提供了线索，也为未来提高基因治疗效力的功能验证提供了丰富的靶点集合。
