《Nature Biotechnology》：Engineered TnpB genome editors for plants and human cells identified by ribonucleoprotein mutational scanning
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这篇研究通讯报道了通过深突变扫描(DMS)技术，全面解析了源自原核转座子的RNA引导性核酸内切酶TnpB的序列-功能图谱。研究者成功鉴定出能够增强其切割活性的蛋白质与RNA(reRNA)突变，并构建了高活性的TnpB变体(eTnpB)。这些工程化变体在人类细胞(HEK293T)及多种植物(本氏烟草、辣椒、水稻)中展现出远超野生型及其他小型编辑器的基因组编辑效率，为实现基于病毒递送等限制性载体的高效、跨物种基因编辑提供了强大工具。
引言背景
TnpB是一类庞大而多样的RNA引导性核酸内切酶家族，与IS200/IS605和IS607等原核转座子相关。因其体积小巧，且被认为是V型CRISPR-Cas12酶系的进化前体，TnpB在基因组编辑领域具有巨大潜力。然而，大多数天然TnpB缺乏稳健的基因编辑活性，限制了其应用。理解TnpB蛋白质序列与其活性之间的关系，既能提供基础生物学见解，也能为工程化改造、提升RNA引导性核酸内切酶的性能奠定基础。
在酵母中筛选TnpB介导的DNA切割
为了探究TnpB蛋白及其引导RNA(reRNA)的突变效应，研究团队将ISDra2 TnpB的reRNA和密码子优化的蛋白编码序列置于独立的调控元件之下。他们改造了一种基于酵母的体内正选择检测系统，利用带有基因组ade2-?报告基因盒的酵母菌株。当TnpB核糖核蛋白复合体在靶位点进行有效切割，引发DNA双链断裂后，细胞能通过同源重组修复ADE2基因，从而能够在缺乏腺嘌呤的选择性培养基上生长。通过比较选择性（-腺嘌呤）和非选择性（+腺嘌呤）条件下的细胞生长情况，即可定量评估内切酶的切割活性。
描绘TnpB reRNA的突变图谱
研究人员首先构建了包含reRNA所有可能的单核苷酸置换、单/双核苷酸缺失、稳定四环替换、已知活性截短体(如Trim2)及失活对照在内的突变文库。通过对这个包含576个变异体的文库进行选择和分析，他们发现了一个有趣的“铰链”区域。这个位于reRNA茎环结构2(stem 2)上的特定区域，包含未配对的核苷酸rA-40–rU-43，其中的单核苷酸缺失或置换突变能够显著增强TnpB的活性，在人类细胞EGFP敲除实验中也得到了验证。研究者推测，这些激活突变可能通过增加茎环2末端的灵活性，促进其在靶DNA结合后被置换，从而更有效地释放并激活催化结构域RuvC。
TnpB蛋白的深突变扫描
接下来，研究团队对ISDra2 TnpB蛋白进行了全面的深突变扫描，构建了包含所有可能单氨基酸置换及终止密码子的突变文库。筛选结果显示，约3.7%的氨基酸置换显示出至少两倍于野生型TnpB的活性。激活突变分布广泛，尤其集中在与核酸结合的界面附近。例如：
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在WED结构域，N4位点被芳香族氨基酸取代，L172位点被小型疏水/亲核氨基酸取代，可能通过增强与异源双链首对碱基的相互作用来稳定初始结合。
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在带正电的中心通道附近，E302位点的负电荷被中和（替换为非负电氨基酸），可能减少了与靶DNA链磷酸骨架的静电斥力。
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位于RuvC活性位点“盖子”亚域边界、参与感应异源双链形成的P282位点，被小疏水氨基酸取代，可能增加了“盖子”的灵活性，加速了TnpB的激活构象变化。
在HEK293T细胞中测试多个高活性单点突变体，其中P282I变体使EGFP敲除效率提升至野生型的近4倍。更重要的是，当将ISDra2 TnpB中发现的激活突变类比地引入结构相似但序列同源性较低的TnpB同源蛋白（如ISYmu1和ISAba30）时，同样观察到了活性的提升，证明了这些激活机制的普适性。
组合突变协同增强TnpB活性
为了获得活性更高的编辑器，研究者从DMS数据中挑选了33个高活性单点突变，通过“切口”突变技术构建了一个平均每个变异体包含约5个突变的组合突变文库。在酵母中对文库进行筛选后，他们鉴定出多个高活性组合变体。在HEK293T细胞中针对多个内源基因位点的测试表明，其中eTnpBd (R110K;P282V;E302Q) 变体展现出最高的插入与缺失频率(23-42%)，显著超越了野生型ISDra2和ISYmu1 TnpB。不过，高活性的变体在部分预测的脱靶位点也表现出稍高的编辑活性。有趣的是，将高活性蛋白变体与高活性reRNA铰链缺失突变组合，并未总是产生叠加效应，有时反而导致活性下降，提示了蛋白质与RNA突变间可能存在复杂的相互作用，需要更精细的配对优化。
用于植物基因组编辑的增强型TnpB变体
TnpB因其紧凑的尺寸，尤其适合载量有限的病毒递送系统，在植物基因编辑中优势明显。研究团队在模型双子叶植物本氏烟草中测试了五个高活性组合变体(eTnpBa-eTnpBe)。通过农杆菌浸润法递送，所有变体在多个靶位点均表现出远高于野生型的编辑效率，其中eTnpBc和eTnpBe (后命名为TnpB-KYLI和TnpB-VGIRL) 尤为突出。在八个不同基因组位点的测试中，TnpB-KYLI和TnpB-VGIRL的编辑效率相较野生型有数倍至50倍以上的提升，在NbNDR1位点分别达到了55%和49%的插入与缺失频率。与野生型TnpB、ISYmu1以及其他小型编辑器如AsCas12f-HKRA、NovaIscB相比，TnpB-KYLI和TnpB-VGIRL在本氏烟草中展现了最高、且可媲美Cas9的编辑水平。此外，它们在预测脱靶位点的编辑活性与野生型TnpB相当或更低，保持了良好的特异性。
研究进一步将这两个变体应用于重要粮食作物水稻和经济作物辣椒。通过农杆菌介导的水稻愈伤组织稳定转化，TnpB-KYLI和TnpB-VGIRL在三个基因组位点均实现了比野生型更高的编辑效率，最高分别达到25.3%和29.3%。在辣椒叶片中通过农杆菌浸润进行瞬时表达，这两个变体在五个靶位点也一致地表现出优于野生型的编辑能力，TnpB-VGIRL在CaAGO2位点的编辑效率达到10%，而野生型低于1%。
讨论与展望
这项工作首次全面绘制了RNA引导性内切酶TnpB的蛋白质和RNA支架的序列-功能图谱。研究发现，尽管TnpB在其天然转座子背景下可能受到功能限制或负向选择，但其核糖核蛋白复合体内部蕴藏着丰富的、可通过点突变释放的潜在活性。研究不仅揭示了与核酸结合、异源双链感应及催化中心激活相关的动态区域和关键残基，还为理解TnpB及CRISPR-Cas12家族的进化与功能提供了新视角。
通过理性组合DMS鉴定出的激活突变，研究者成功获得了TnpB-KYLI和TnpB-VGIRL等高效变体。这些工程化编辑器在人类细胞、模式植物及重要作物中均展现出卓越的基因组编辑能力，特别是其小巧的尺寸与高效率的结合，使其成为通过病毒载体实现无转基因、可遗传植物基因组编辑的理想工具。未来，进一步探索递送方法、拓展TAM识别范围，并结合深入的生化与结构研究，将能更大程度地挖掘TnpB在基础研究和生物技术应用中的潜力。
