《Nature Cell Biology》：Peritumoural adipose tissue promotes ferroptosis resistance by 3-hydroxykynurenine-mediated suppression of ferritinophagy
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这篇研究报告揭示，肿瘤周缘脂肪组织（PAT）通过分泌大尿氨酸（KYN），在肿瘤细胞内代谢为3-羟基大尿氨酸（3-HK）。3-HK直接结合核受体共激活因子4（NCOA4），抑制铁蛋白自噬，导致铁蛋白（FTH1/FTL）蓄积和细胞内游离铁减少，从而赋予肿瘤细胞铁死亡抵抗性。在动物模型中，抑制KYN通路与PD-1阻断疗法协同作用，可克服铁死亡抵抗并抑制肿瘤进展。这为靶向脂肪-肿瘤交互作用以增强PAT相关肿瘤的免疫治疗提供了新策略。
PAT赋予肿瘤铁死亡抵抗性并降低免疫治疗疗效
在晚期结直肠癌（CRC）和胃癌（GC）中，肿瘤常侵犯浆膜并直接接触内脏脂肪组织。为探究PAT是否影响铁死亡，研究团队建立了两种体内模型：将CRC肿瘤植入小鼠背中部皮下（非脂肪部位）或腹股沟白色脂肪组织（iWAT，脂肪相关部位）。结果发现，与皮下肿瘤相比，植入iWAT的肿瘤对由GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）或SLC7A11（胱氨酸转运蛋白）诱导性敲低所触发的铁死亡更具抵抗性。在免疫健全的C57BL/6J小鼠中，iWAT植入的MC38肿瘤对铁死亡诱导剂咪唑酮erastin（IKE）的敏感性也显著降低。有趣的是，PAT仅在免疫健全小鼠中促进肿瘤生长，而在免疫缺陷鼠中无此效应，该促瘤效应在CD8+T细胞耗竭后消失。这提示PAT保护肿瘤免受外源性铁死亡诱导剂和内源性CD8+T细胞介导的铁死亡应激的双重攻击。此外，与皮下肿瘤相比，iWAT植入的CRC肿瘤对抗PD-1治疗的反应减弱。在临床样本中，与解剖学上仍与脂肪间隔分离的I期肿瘤相比，已侵犯浆膜（即与脂肪组织接触）的III-IV期CRC肿瘤的脂质过氧化信号（4-HNE/MDA）显著减弱。这些结果共同证明，PAT赋予癌细胞铁死亡抵抗性，从而损害抗肿瘤免疫力并降低免疫检查点治疗的疗效。
PAT通过铁蛋白介导的铁隔离赋予肿瘤铁死亡抵抗性
为探究机制，研究建立了脂肪来源条件培养基（adipose-CM）体外模型。脂肪-CM能显著减弱RSL-3诱导的脂质过氧化和铁死亡。定量蛋白质组学分析显示，经脂肪-CM处理的肿瘤细胞中，铁蛋白重链（FTH1）和轻链（FTL）显著上调。免疫印迹证实了FTH1/FTL的选择性诱导，而其他铁相关蛋白或细胞内谷胱甘肽（GSH）水平未改变，表明这是一种不依赖GSH的、以铁蛋白上调为中心的机制。FerroOrange染色显示，脂肪-CM处理细胞内的游离Fe2+减少，表明铁蛋白增加并非由铁积累引起。FTH1和FTL的双重敲低可逆转这种Fe2+耗竭，并消除脂肪-CM对RSL-3诱导的铁死亡的保护作用，表明铁蛋白是脂肪-CM介导的细胞保护所必需的。在体内，从富含脂肪的腹股沟部位分离的MC38肿瘤细胞显示出更高的FTH1/FTL表达、更低的细胞内Fe2+、更低的脂质过氧化和更强的铁死亡抵抗性。在脂肪丰富的腹膜转移模型中，肿瘤也表现出更高的FTH1/FTL表达，且FTH1/FTL敲低抑制了腹膜肿瘤的进展。这些结果共同证明，PAT通过上调铁蛋白以隔离细胞内铁，从而赋予铁死亡抵抗性。
PAT建立富含KYN的肿瘤微环境以提升癌细胞中铁蛋白水平
脂肪-CM中上调FTH1/FTL的活性是热稳定的，且能通过3 kDa滤膜，指向小分子代谢物是活性因子。代谢组学分析鉴定出犬尿氨酸（KYN）是唯一在脂肪-CM和iWAT植入的MC38肿瘤中均持续升高的代谢物。KYN剂量依赖性地增加FTH1/FTL，降低细胞内Fe2+，并抑制RSL-3诱导的脂质过氧化和铁死亡。肿瘤间质液（TIF）的靶向代谢组学证实，与皮下肿瘤相比，PAT相关肿瘤的TIF中KYN升高（高达50 μM）而色氨酸（TRP）耗竭。脂肪-CM也增加了细胞内的KYN。PAT表达比肿瘤组织本身更高水平的吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）和色氨酸2,3-双加氧酶2（TDO2），它们是催化TRP生成KYN的关键酶。用IDO1/TDO2抑制剂预处理后获得的脂肪-CM无法上调FTH1/FTL，而添加外源性KYN可挽救此效应。与对侧正常iWAT相比，MC38荷瘤小鼠的PAT及其条件培养基中的KYN水平显著更高，证实了肿瘤相邻微环境中KYN产生的特异性增强。对PAT的单核RNA测序（snRNA-seq）显示，Ido1在脂肪细胞中高表达，而Tdo2在前脂肪细胞（pACs）和脂肪源性干细胞（ASCs）中高表达，这些细胞是KYN产生的主要贡献者。这些发现表明，PAT通过建立富含KYN的肿瘤微环境，驱动铁蛋白上调、铁隔离和铁死亡抵抗。
KYN衍生的3-HK是PAT介导肿瘤铁死亡抵抗的关键因子
KYN被癌细胞摄取并代谢为下游产物。在TRP-KYN通路的中间产物中，KYN、3-羟基犬尿氨酸（3-HK）和3-羟基邻氨基苯甲酸（3-HAA）能赋予癌细胞铁死亡抵抗性。遗传学实验进一步揭示了它们的作用：在KYN补充的培养中，敲低将KYN转化为3-HK的KYN单加氧酶（KMO）会降低FTH1/FTL，增加Fe2+水平，增强脂质过氧化并使细胞对铁死亡敏感；相反，沉默将3-HK转化为3-HAA的犬尿氨酸酶（KYNU）则增强了KYN的效应，进一步升高FTH1/FTL，降低Fe2+和脂质过氧化，并保护细胞免于死亡。这些相反的结果强烈表明3-HK是驱动铁蛋白积累的关键代谢物。直接补充3-HK可剂量依赖地上调FTH1/FTL，降低不稳定铁，抑制脂质过氧化并增强铁死亡抵抗。3-HK或KYN不影响FTH1/FTL的mRNA水平，脉冲追踪实验显示3-HK延缓了FTH1的降解，表明其通过抑制铁蛋白的分解来稳定铁蛋白。由于铁蛋白通过NCOA4介导的铁蛋白自噬降解，研究假设3-HK通过抑制此过程来稳定铁蛋白。3-HK处理降低了癌细胞中的溶酶体Fe2+。此外，在NCOA4敲除（KO）细胞中，3-HK和KYN均无法上调铁蛋白和降低细胞内Fe2+。3-HK对RSL-3的保护作用在NCOA4-KO细胞中也减弱。值得注意的是，低剂量3-HK（5 μM）足以上调铁蛋白水平并抑制铁死亡，且此保护作用在FTH1或NCOA4缺陷细胞中丧失，证实抑制铁蛋白自噬是其核心机制。芳香烃受体（AHR）敲除并不损害3-HK介导的FTH1/FTL上调，排除了AHR的参与。3-HK介导的FTH1/FTL上调也独立于NRF2/SLC7A11抗氧化轴和CD44介导的铁摄取。总之，这些发现描绘了一条代谢物驱动的轴：PAT来源的KYN在肿瘤细胞内转化为3-HK，导致NCOA4介导的铁蛋白降解被抑制，铁生物利用度降低，铁死亡抵抗增强。
3-HK直接结合NCOA4并阻断铁蛋白自噬的启动
为阐明3-HK如何调节铁蛋白自噬，研究调查了其对NCOA4和FTH1之间相互作用的影响，这是启动铁蛋白自噬的关键步骤。免疫荧光（IF）分析显示，3-HK或KYN处理显著降低了肿瘤细胞中FTH1和NCOA4的共定位。免疫共沉淀（Co-IP）实验证明3-HK削弱了FTH1与NCOA4的结合。KYNU敲低同样减弱了FTH1与NCOA4的结合，而KMO敲低则产生相反效果。体外pull-down实验表明，3-HK特异性抑制了FTH1与NCOA4的直接结合，而KYN或下游代谢物3-HAA无此效应。热位移实验显示，3-HK以剂量依赖的方式稳定NCOA4抵抗热变性，提示3-HK与NCOA4之间存在直接的物理相互作用。链霉亲和素pull-down和Duolink邻位连接技术（PLA）证实了3-HK与NCOA4的相互作用。表面等离子共振（SPR）和生物层干涉（BLI）进一步表征了3-HK与NCOA4的直接结合，解离常数约为0.5-0.8 μM，而KYN或3-HAA未检测到与NCOA4的结合。这些发现共同证明，3-HK直接结合NCOA4，破坏其与FTH1的相互作用，从而抑制铁蛋白自噬。
靶向KYN生物合成使PAT相关肿瘤对铁死亡和免疫治疗敏感
基于PAT中IDO1/TDO2上调的观察，研究假设其药理学抑制将降低局部KYN，进而降低瘤内3-HK和铁蛋白。用IDO/TDO抑制剂（epacadostat和LM10）治疗确实显著降低了PAT中的KYN和肿瘤中的3-HK。免疫印迹证实了相应的FTH1、FTL和NCOA4下调，与铁蛋白自噬增强一致。在BALB/c小鼠的iWAT植入CT26肿瘤模型中，IDO1/TDO2抑制剂增强了GPX4敲低诱导的铁死亡。在免疫缺陷裸鼠的DLD1异种移植瘤和结直肠癌患者来源异种移植（PDX）模型中，也观察到类似的增敏作用。在免疫健全的C57BL/6J小鼠MC38肿瘤模型中，IDO1/TDO2抑制剂与IKE联合显示出协同抗肿瘤效应。由于抗PD-1疗法可促进CD8+T细胞介导的铁死亡，研究假设抑制IDO1/TDO2可能使PAT相关肿瘤对抗PD-1治疗敏感。实验证实，虽然抗PD-1单药对iWAT植入肿瘤疗效有限，但IDO1/TDO2抑制剂与抗PD-1抗体联合进一步增强了肿瘤抑制，且此增强效应可被铁死亡抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1）逆转。在腹膜转移模型中，联合治疗的益处也得到了验证。因此，靶向IDO1/TDO2是克服铁死亡抵抗并增强PAT丰富型癌症免疫治疗疗效的一种有前景的策略。
PAT相关的铁蛋白调控轴与恶性肿瘤进展和ICB反应相关
为临床验证PAT-铁蛋白轴，研究分析了发生腹膜转移的GC患者的影像学数据。与原发性肿瘤相比，腹膜转移灶对新辅助化疗-免疫治疗的反应更差。对另一队列配对组织标本的免疫组化分析显示，与原发性肿瘤部位相比，腹膜转移灶中FTH1和FTL的表达显著更高，而脂质过氧化标志物4-HNE的水平降低。此外，反映3-HK升高的KMO高/KYNU低特征，与CRC和GC的晚期分期和更差的生存期相关。这些结果表明，该通路的激活促进了PAT丰富型癌症的治疗抵抗，并可能作为免疫治疗结果的预测性生物标志物。
讨论
本研究揭示了PAT通过提升3-HK、抑制铁蛋白自噬来保护肿瘤细胞免于铁死亡并损害免疫治疗的机制。研究发现PAT在肿瘤微环境中升高L-KYN水平，导致其下游代谢物3-HK在细胞内增加。除了已知的抗氧化作用，研究证明3-HK直接抑制铁蛋白自噬。它上调铁蛋白并消耗不稳定铁，且不依赖于NRF2或AHR。虽然3-HK在浓度高达50 μM时仅表现出弱的自由基捕获抗氧化剂（RTA）活性，但低至5 μM的3-HK就足以上调铁蛋白水平并抑制铁死亡，且此保护作用在FTH1或NCOA4缺陷细胞中丧失，证实抑制铁蛋白自噬是其核心机制。鉴于铁蛋白自噬在释放溶酶体铁以触发铁死亡中的既定作用，3-HK介导的对此过程的抑制代表了PAT赋予铁死亡抵抗性的关键机制。新兴证据表明代谢物不仅是生物底物，也是关键的信号分子。本研究证明3-HK作为铁蛋白自噬和铁稳态的内源性调节剂。值得注意的是，细胞铁可用性通过血红素生物合成影响TRP和KYN代谢，因为血红素是IDO1和TDO2的必需辅因子。这表明铁稳态和TRP代谢之间存在双向调节回路，可能由3-HK介导。癌症免疫疗法已彻底改变了癌症治疗。然而，相当大比例的患者，特别是伴有腹膜转移的CRC和GC患者，对ICB反应不佳。本研究发现IDO1和TDO2在PAT中均高表达，驱动KYN积累并赋予铁死亡抵抗性。由于铁死亡是免疫原性的，本研究的发现表明，双重抑制IDO1和TDO2可能与免疫疗法协同改善疗效。总之，本研究揭示了PAT通过提升3-HK、抑制铁蛋白自噬来保护肿瘤细胞免于铁死亡并损害免疫治疗的机制。这些发现加深了我们对PAT与抗肿瘤免疫力之间机制联系的理解，并凸显了靶向3-HK介导的铁调节的治疗潜力。
