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为解决有益菌根共生中跨界RNA干扰(ckRNAi)是否存在及其作用机制的问题，研究人员在《Nature Plants》上发表了关于丛枝菌根(AM)的研究。他们证实，真菌Rhizophagus irregularis能将小RNA(RisRNAs)转移至宿主植物Lotus japonicus的细胞中，并载入植物的AGO1/RNA诱导沉默复合体，通过沉默与植物防御相关的宿主基因来促进其定殖。该发现确立了生物间RNA交流是调控这一古老共生关系的新机制。
在自然界的地下网络中，一场悄无声息的“对话”每天都在上演。大约80%的陆生植物都与从梗霉亚门(Glomeromycotina)的真菌形成一种被称为丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM)的互利共生关系。这种古老的合作关系（大约起源于4.5亿年前）对植物的营养吸收和生长表现至关重要，因此在可持续农业应用中备受关注。真菌从土壤中收集矿物质养分，通过其在根皮层细胞内形成的、高度分枝的丛枝(arbuscules)结构释放给植物；作为回报，它们从宿主植物那里获得以糖类和脂质形式存在的有机碳。一个由所谓的“共同共生基因”编码的植物信号网络确保了一个相容的相互作用，并允许真菌在根细胞内“安家落户”。然而，真菌似乎还需要克服在定殖初始阶段以及含有丛枝的细胞中可能被激发的植物防御反应，这些反应可能由其细胞壁脱落的几丁质或β-葡聚糖片段所引发。
近年来，跨界RNA干扰(cross-kingdom RNA interference, ckRNAi)已成为植物-微生物互作领域的一个新兴概念。在植物-病原体相互作用中，真菌和卵菌病原体可以将小RNA(small RNAs, sRNAs)传递到植物细胞内，以促进感染。这些病原体sRNA会载入植物自身的Argonaute(AGO)蛋白/RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex)中，从而沉默在植物防御中起作用的宿主信使RNA(mRNAs)。这种交流是双向的，植物也会将sRNA转移到入侵的病原体中用于防御。根瘤菌和某些外生菌根真菌也被发现能向宿主根部释放sRNA以支持定殖和共生。此前已有研究发现，从枝菌根真菌Rhizophagus irregularis的一种sRNA (Rir2216)能转移到Medicago truncatula根部，沉默一个WRKY转录因子以促进共生。然而，与病原真菌分属不同进化支（从梗霉亚门）且生活方式迥异的AM真菌，是否也广泛地利用ckRNAi来调控与宿主的共生关系，仍是一个引人入胜的假说。
为了探寻ckRNAi在AM共生中存在的证据，研究人员以模型真菌R. irregularis和模型豆科植物Lotus japonicus为对象展开了研究。他们首先通过AGO1共免疫沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)结合深度测序，从被定殖的L. japonicus根中鉴定出与植物AGO1蛋白结合的R. irregularis来源的sRNAs (RisRNAs)。他们设计了一种巧妙的“开关式”ckRNAi报告系统，在L. japonicus毛状根中瞬时表达，直观地证明了RisRNAs在共生组织中被转移并引发了序列特异性的基因沉默。为了验证这些RisRNAs的功能重要性，他们采用了短串联靶标模拟(short-tandem-target-mimic, STTM)策略，在植物中同时“海绵吸附”四种候选RisRNAs，结果发现这显著降低了真菌的根定殖率。此外，体外的切割实验也证实了RisRNAs能够在植物AGO1蛋白的介导下，切割预测的靶标mRNA。
一、R. irregularissRNAs与LjAGO1结合**
为了鉴定可能在根部诱导ckRNAi的候选R. irregularissRNAs，研究人员分析了L. japonicusAGO1在根定殖过程中的sRNA载荷。他们使用了针对拟南芥(Arabidopsis thaliana) AGO1蛋白氨基末端部分制备的抗体进行共免疫沉淀。系统发育树和蛋白组学质谱分析证实，该抗体能特异性下拉LjAGO1，而不与真菌AGO蛋白交叉反应。从接种了真菌(AM)或未接种(对照)的L. japonicus根中成功进行LjAGO共IP后，他们通过茎环反转录PCR检测到植物自身的microRNAs (如LjmiR166和LjmiR396)，验证了实验的成功。随后对共IP得到的sRNAs进行克隆和深度测序。将 reads 映射到L. japonicus参考基因组后，他们发现了大小为21个核苷酸、具有5‘端尿嘧啶(U)偏好性的sRNAs的富集，这与之前研究中对AtAGO1共IP sRNA的分析结果一致。有趣的是，未能完美匹配植物基因组的 reads 中，有0.09–3.6% 特异性地出现在真菌定殖的根样本中，并能映射到R. irregularis的参考基因组上。这些真菌来源的RisRNAs显示出21-24个核苷酸的大小富集和5‘端U偏好性，这使研究人员确信RisRNAs在根定殖过程中载入了LjAGO。对RisRNAs的基因组来源分析显示，大部分序列来自DNA重复区域（包括转座子和重复序列），其次来自mRNAs，这与病原真菌Botrytis cinerea的跨界sRNAs特征相符。研究人员最终确定了12个在所有真菌定殖样本中都与LjAGO1相关、且丰度较高的RisRNAs，并预测了它们潜在的23个L. japonicus靶基因，其中一些可能与植物防御相关。
二、RisRNAs被转移至宿主植物并促进定殖**
为了直接证明RisRNAs在AM发育过程中能引发ckRNAi，研究人员设计并构建了“开关式”ckRNAi报告载体，并将其在L. japonicus毛状根中瞬时表达。该报告系统的核心是一个双组分结构：组成型表达的GUS报告基因被CRISPR型RNA核酸酶Csy4持续抑制，而Csy4基因的表达则由一个预测的靶基因（例如果胶甲酯酶基因）的启动子控制。在Csy4转基因序列的两端，研究人员融合了两个候选RisRNAs的预测靶序列。其原理是，如果RisRNAs被转移到根细胞中，并能够沉默这些融合的靶序列，就会导致Csy4mRNA被清除，从而解除对GUS报告基因的抑制，使其表达。实验结果显示，用R. irregularis接种后，仅在真菌定殖的组织（特别是丛枝和根内菌丝附近的内皮层细胞）中观察到了GUS报告活性。而未接种的根在任何时候都没有GUS激活。当使用含有打乱序列靶位点的对照报告载体时，即使有真菌定殖，也未观察到任何GUS激活。这一结果强有力地证明，R. irregularis在AM发育过程中确实在L. japonicus根中诱导了序列特异性的ckRNAi。
三、RisRNAs的功能重要性验证**
为了理解这些被转移的RisRNAs是否对AM发育具有实际功能，研究人员采用了STTM策略来阻断RisRNAs在L. japonicus中的基因沉默作用。他们构建了一个能同时“海绵吸附”四种候选RisRNAs (RisRNA8, 11, 15, 23)的四联STTM载体，并在L. japonicus毛状根中表达，然后接种R. irregularis。与表达空载体的对照根相比，表达STTM的根显示出显著降低的真菌定殖水平。而表达含有打乱RisRNA靶位点的STTM抗性(rs)版本的根，其定殖水平则未受影响。这表明RisRNAs的吸附效应是序列特异性的，也反证了这些RisRNAs对促进真菌定殖是必要的。通过动态监测靶基因的表达，研究人员发现，在STTM表达的根中，部分预测的靶基因在特定时间点的表达水平有所升高，这符合如果沉默是通过mRNA切割实现，则sRNA被吸附后靶基因表达应上升的预期。其中，RisRNA8和一个RisRNA23的预测靶基因表现出这种模式，提示这些RisRNAs可能通过AGO1介导的切割来调控其部分靶标。
结论与讨论
本研究提供了确凿的证据，表明AM真菌R. irregularis在定殖宿主植物L. japonicus根部期间，会将RisRNAs转移至根细胞中。这些真菌sRNA能载入植物的LjAGO1蛋白，从而诱导跨界RNA干扰(ckRNAi)。功能实验证明，RisRNAs能促进AM共生体的发育，其机制很可能是通过抑制与植物防御和/或其他对根定殖有抑制作用的基因的mRNA来实现。研究所聚焦的四种RisRNAs被预测靶向多个可能阻碍真菌定殖的基因，例如一个TIR-NB-LRR类疾病抗性基因、一个果胶酯酶基因、一个黄素单加氧酶基因、一个环核苷酸门控通道(CNGC)基因以及一个NAC域转录因子基因NTM1-like 9的同源物。这些靶点可能分别通过激活免疫信号、增加细胞壁硬度、产生有毒代谢物或转录激活防御相关基因来发挥作用。因此，通过ckRNAi抑制植物免疫，可能为真菌的成功定殖打开了“入口”。
然而，通过“开关式”RNAi报告系统的观察也提示，ckRNAi可能仅以高度局部化的方式发生在有限数量的、靠近真菌菌丝的细胞或已被定殖的皮层细胞中。这使得植物能够在大部分外层根细胞中维持防御能力。这一发现不仅为理解AM这一地球上最广泛的共生关系提供了一个全新的调控视角——生物间的RNA交流，也将其与病原互作中的类似机制联系起来，揭示了不同界生物之间利用sRNA进行“分子对话”的普遍性。研究还提出了许多有趣的问题，例如RisRNAs是如何被转移进根细胞的（可能与在共生界面观察到的活跃的囊泡运输有关），以及植物是否也通过细胞外囊泡将sRNA传递给AM真菌以调控其基因表达。对这些问题的深入探索，将帮助我们更全面地理解这一古老共生关系的建立与维持机制，并为农业应用提供新的思路。本研究发表于《Nature Plants》，标志着对共生体系中跨界RNA交流机制理解的重要突破。
