《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Phase 1 pilot study for hemophilia-A: AAV8 vector with prophylactic tacrolimus-glucocorticoid achieves therapeutic FVIII activity
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为了应对A型血友病（Hemophilia A, HA）基因治疗中面临的载体免疫反应和FVIII表达不稳定等关键挑战，研究人员开展了一项利用AAV8载体（GS001）编码B区缺失FVIII，并联合预防性他克莫司-糖皮质激素免疫抑制的I期临床研究。结果表明，该疗法能快速、安全地诱导并维持治疗水平的FVIII活性，显著降低患者年化出血率（ABR）和FVIII消耗，为提升基因疗法疗效与持久性提供了新策略。
对于罹患A型血友病（Hemophilia A, HA）的患者而言，身体内缺乏或功能异常的凝血因子VIII（FVIII）让每一次小小的磕碰都可能演变成危险的出血。尽管定期输注重组FVIII是目前的标准预防方案，但它需要频繁静脉注射，给患者生活带来沉重负担，且在中国，由于经济等因素，许多患者难以获得足量预防，导致关节反复出血、逐渐毁损，生活质量严重下降。基因治疗带来了“一劳永逸”的希望，通过一次静脉输注携带FVIII基因的病毒载体，让患者肝脏能长期自行生产FVIII。然而，理想丰满，现实骨感。目前用于递送基因的腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）载体常常会激发人体的“排异反应”——免疫系统会攻击那些被病毒转染、正在生产FVIII的肝细胞，导致FVIII水平不升反降，甚至损伤肝脏，表现为转氨酶（如ALT）升高。此外，FVIII蛋白本身分子量大、结构复杂，在肝脏细胞内的稳定表达也是一大难题。如何既能让FVIII基因高效、持久地工作，又能“安抚”好过于警觉的免疫系统，成为了血友病基因治疗领域亟待突破的瓶颈。
在此背景下，一项由中国团队主导的开创性临床研究在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上发表。研究者们尝试用一套“组合拳”来破局：一方面，使用一种名为GS001的新型AAV8血清型载体，其装载了经过密码子优化、去除B区（B-domain–deleted）的人FVIII基因，并配备了特殊设计的高效肝脏特异性启动子，旨在提升基因递送和表达效率。另一方面，研究团队创新性地在输注载体前一周，就开始给患者使用预防性的免疫抑制剂——不仅用经典的糖皮质激素（泼尼松），还加用了另一种强效的T细胞抑制剂他克莫司（Tacrolimus），旨在从源头压制可能被AAV载体激活的、特别是具有细胞毒性的CD8+T细胞的免疫反应，为FVIII基因的稳定表达创造一个“友好”的体内环境。
为了评估这一联合策略的安全性与有效性，研究人员开展了一项前瞻性I期剂量递增研究。研究纳入了12名成年重型A型血友病患者，他们被分为两组，分别接受低剂量（2×1012载体基因组/公斤体重）和高剂量（4×1012载体基因组/公斤体重）的GS001单次静脉输注。所有患者均在输注前一周开始接受泼尼松预防，其中9名患者（从第4位受试者开始）额外联合了他克莫司。研究者对患者进行了长达104至208周不等的随访，系统监测了FVIII活性水平、出血事件、不良事件以及复杂的免疫反应变化。
关键研究方法概览
本研究采用了标准的I期临床试验设计，在中国单一中心进行。核心干预是单次静脉输注GS001载体，并联合预防性免疫抑制方案。疗效评估主要依赖于临床指标（年化出血率ABR、FVIII用量）和实验室检测（一期法FVIII活性FVIII:C）。安全性通过不良事件（AE）和严重不良事件（SAE）记录，特别是肝酶（ALT/AST）水平监测。为深入探究免疫机制，研究运用了酶联免疫斑点试验（ELISpot）检测AAV特异性T细胞反应，流式细胞术分析他克莫司对T细胞亚群增殖的影响，并对患者外周血单核细胞（PBMCs）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以在转录组水平解析免疫细胞动态。
研究结果
参与者招募与AAV输注剂量
2011年3月至2023年5月期间，共筛查了40名患者，最终12名患者入组两个剂量队列（每组6人）。所有患者基线特征相似，均被纳入安全性、全分析和药效学分析集。
GS001基因治疗在重型HA中的基因递送和表达效率评估
输注后，FVIII:C水平迅速上升。在低剂量组，FVIII:C中位峰值出现在输注后5.5周，达到80.4 IU/dL（正常范围：50-150 IU/dL）；在144周时，中位FVIII:C为5.6 IU/dL，其中3名患者维持在轻度血友病水平（>5 IU/dL）或正常水平。在高剂量组，FVIII:C上升更快更高，一周内即达到近正常水平，峰值中位数高达288.2 IU/dL；在104周时，中位FVIII:C为42.7 IU/dL，所有6名患者的FVIII水平均维持在29 IU/dL以上，处于非血友病状态（>40 IU/dL为轻度血友病上限）。探索性分析显示，在低剂量组中，联合使用他克莫司的受试者（4-6号）其FVIII:C水平的上升速度和峰值均高于仅使用泼尼松的受试者（1-3号）。
两种剂量的GS001输注均显著缓解HA患者的症状
治疗后，患者的临床获益显著。低剂量组和高剂量组的年化出血率（ABR）中位数分别从治疗前的11.0和12.5次，降至0.8和0次。年化FVIII使用量中位数也大幅下降，高剂量组中有患者甚至在后续接受膝关节置换等大手术时也未再需要外源性FVIII输注。所有患者均停止了预防性FVIII治疗。
评估GS001基因治疗在重型HA中的不良事件
GS001输注总体安全且耐受性良好。最常见的治疗相关不良事件是肝酶升高，在低/高剂量组中分别有3名和5名患者出现ALT升高，绝大多数为1-2级。高剂量组有2例出现3倍正常值上限（ULN）的ALT升高。所有免疫抑制剂相关不良事件（如白细胞增高、痤疮、血肌酐轻度—过性升高等）均为轻度，无严重不良事件归因于免疫抑制剂。未报告血栓事件或死亡。
评估两个剂量队列中由GS001输注诱导的体液和细胞免疫反应
所有受试者在输注后一周均产生了高滴度的AAV中和抗体，并持续存在，但未检测到FVIII抑制剂。细胞免疫反应监测显示，高剂量组一名受试者的AAV特异性T细胞反应与FVIII:C下降及ALT升高在时间上相关。事后分析发现，输注后第7天特异性T细胞计数较高的受试者，其FVIII峰值后的下降率（≥80%）也更高。
治疗浓度的他克莫司在体外抑制来自GS001输注受试者的活化CD8+T细胞增殖，但不抑制CD4+T细胞
体外实验表明，治疗浓度的他克莫司（1 μg/mL）能显著抑制从治疗后患者血液中提取的、经激活的CD8+T细胞的增殖，并降低其在T细胞中的比例，但对CD4+T细胞无显著影响。这为他克莫司在体内选择性抑制细胞毒性T细胞反应提供了直接证据。
对输注GS001前后PBMCs的单细胞RNA测序与分析，确定了CD8+T细胞中的I型干扰素通路可作为监测和干预特异性T细胞免疫的潜在靶点
单细胞转录组分析揭示了免疫细胞的动态变化。与输注前相比，输注后第3天和第28天，PBMCs中T/NK细胞比例下降，而单核细胞和B细胞比例上升。重要的是，基因集富集分析显示，经泼尼松联合他克莫司预处理后，患者CD8+T细胞中的炎症反应、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）信号通路均被显著抑制。差异表达基因分析鉴定出多个干扰素相关基因（如DDIT4、IRF7、ISG15、STAT2等）在输注后下调。后续定量PCR验证发现，这些基因的表达下调与FVIII:C的下降阶段相关，提示它们可能作为预测FVIII表达下降的早期生物标志物。
研究结论与意义
这项I期研究表明，GS001（一种AAV8-hFVIII载体）联合预防性他克莫司-糖皮质激素方案，能在重型A型血友病患者中安全实现快速、强劲且持久的治疗性FVIII表达。高剂量组（4×1012vg/kg）在两年随访期内使所有患者FVIII水平维持在非血友病状态以上，并近乎消除自发性出血，展示了卓越的疗效。
该研究的核心意义在于为攻克血友病基因治疗的免疫屏障提供了创新性策略。首先，它证实了在输注前即开始“预防性”联合免疫抑制（特别是加入他克莫司）的有效性，这不同于许多研究中出现肝酶升高后再“补救性”给药的模式，可能更主动地保护了转导的肝细胞，从而获得了更快更高的FVIII峰值以及更持久的表达。其次，通过scRNA-seq等前沿技术，研究不仅验证了联合方案能有效抑制CD8+T细胞的关键炎症通路，还发掘出如DDIT4、IRF7等潜在的早期监测靶点，为未来实现个体化、精准化的免疫管理提供了线索。最后，GS001在相对较低的载体剂量下（显著低于已获批的Roctavian的6×1013vg/kg）实现了具有竞争力的疗效，这有助于降低生产成本和潜在毒性，对于像中国这样患者基数大、治疗负担重的国家具有重要的公共卫生意义。
当然，研究也存在随访时间仍不够长、样本量较小等局限性，其长期疗效和安全性仍需III期研究（NCT06833983）进一步验证。但毋庸置疑，这项由中国团队主导的研究，通过巧妙的载体设计与免疫策略组合，成功地在血友病基因治疗这一高端赛道上取得了突破性进展，为全球患者，特别是医疗资源有限地区的患者，带来了新的希望。
