《Nature Communications》：RejuAgro A as an antimicrobial for fire blight control of pome fruits and beyond
编辑推荐：
为解决梨火疫病等植物病害防治过度依赖传统抗生素、耐药性问题凸显的困境，研究人员从土壤假单胞菌中鉴定出一种新型抗菌剂RejuAgro A (RAA)。该研究证明RAA能高效抑制包括链霉素抗性菌株在内的Erwinia amylovora，田间防效与链霉素相当，其作用机制独特，可同时抑制RNA、DNA和蛋白质合成。RAA的发现为植物病害的可持续管理和应对抗生素耐药性提供了有前景的替代方案。
想象一下，全球苹果和梨产业的“头号杀手”——梨火疫病，正悄无声息地摧毁着果园。这种由病原细菌Erwinia amylovora引起的毁灭性病害，在全球主要的水果产区肆虐，不仅导致减产，甚至能让果树枯死。为了对抗它，果农们长期以来高度依赖链霉素、土霉素等抗生素。然而，这把“双刃剑”带来了严峻的挑战：耐药性菌株在美国各大产区几乎无处不在，甚至有菌株对土霉素也产生了抗性。更令人担忧的是，农业上大量使用人用抗生素，可能加剧细菌耐药性的产生与传播，威胁人类健康。同时，替代品如铜制剂效果较差且可能产生药害。面对传统抗生素效力下降、环境与健康风险增加的双重压力，寻找高效、安全、不易产生耐药性的新型植物病害防控药剂，已成为农业可持续发展亟待解决的重大问题。
在此背景下，一项发表于《Nature Communications》的研究带来了令人振奋的消息。研究人员从美国威斯康星州的土壤中，筛选了超过4万株细菌，最终锁定了一株具有强大抑菌活性的菌株——Pseudomonas soli 0617-T307。他们从这株细菌中成功分离并鉴定出一种全新的抗菌化合物，命名为RejuAgro A (RAA)。这项研究不仅揭示了RAA卓越的防控效果和独特的作用机制，还解析了其生物合成途径，为开发新一代植物保护剂奠定了坚实基础。
为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术与方法。在样本获取与鉴定方面，他们从美国威斯康星州的森林、湖岸、沼泽等多种自然环境中广泛采集土壤样本，分离细菌。通过多基因位点序列分析、全基因组测序及平均核苷酸一致性（ANI）比对，准确鉴定了产RAA的菌株为Pseudomonas soli。在化合物发现与表征环节，研究采用了活性导向的分离策略，包括硅胶柱层析、制备型高效液相色谱（HPLC）对活性成分进行分离纯化，并利用高分辨质谱（HR-MS）和X射线晶体学确定了RAA和其中间体RejuAgro B (RAB)的分子式与三维化学结构。在基因功能验证方面，通过生物信息学工具AntiSMASH预测次级代谢产物生物合成基因簇（BGC），并利用同源重组双交换法构建了系列基因敲除和回补突变株，以确定负责RAA合成的关键基因（ras1-ras6）。抗菌活性评估则严格遵循临床和实验室标准协会（CLSI）的微量肉汤稀释法，测定了RAA对多种植物病原细菌、真菌以及部分医学相关细菌的最小抑菌浓度（MIC）。在田间药效试验中，研究团队在美国加利福尼亚州、康涅狄格州、密歇根州和纽约州等多个地理气候条件迥异的产区，针对当地主栽的苹果和梨品种，进行了为期三年的随机区组设计田间试验，评估了RAA在不同浓度下防控梨火疫病的实际效果。此外，还通过大分子合成抑制实验（使用3H标记的胸苷、尿苷和亮氨酸）探究了RAA的抗菌机制，并利用谷胱甘肽（GSH）保护实验和二维主成分分析（PCA）进一步阐释了其作用特点。
研究结果
鉴定Pseudomonas soli 0617-T307
研究人员从威斯康星州多样化土壤中分离了大量细菌，通过活性筛选发现菌株0617-T307的提取物及其与E. amylovora的共培养物均能强烈抑制病原菌生长。通过多基因系统发育分析和全基因组比较，将该菌株鉴定为Pseudomonas soli，并保藏于美国模式培养物集存库（ATCC）。
发现P. soli 0617-T307产生的抗菌化合物
对P. soli发酵产物进行提取、硅胶柱层析和制备型HPLC分离，最终得到纯化的活性化合物。高分辨质谱和X射线晶体学分析确定其分子式为C7H7NO3S，分子量为185.2 Da，并将其命名为RejuAgro A (RAA)。
RAA对E. amylovora显示出与链霉素相当的强效抗菌活性
最小抑菌浓度（MIC）测定显示，RAA对高毒力株Ea110和低毒力株Ea1189的MIC为5 μg/mL，与链霉素效果相当。更重要的是，RAA对三个链霉素抗性菌株（CA11, DM1, Ea88）同样有效，MIC为10 μg/mL。此外，RAA对多种其他植物病原细菌（如Xanthomonas, Ralstonia）和真菌（如Phytophthora infestans, Venturia inaequalis）也表现出广谱抑菌活性。
评估RAA在田间试验中控制梨火疫病的功效
在美国东西部多个州进行的多年多地点田间试验表明，RAA能有效降低梨火疫病的发病率。在多数试验中，20 ppm的RAA其防效即可与100 ppm的链霉素或春雷霉素相当。例如，在2023年纽约的苹果试验中，20 ppm RAA处理后的病害发生率（7%）甚至低于100 ppm链霉素的处理（18%），显示出卓越的防控潜力。
鉴定P. soli中RAA的生物合成基因簇
通过AntiSMASH分析P. soli基因组，预测了10个可能的次级代谢产物生物合成基因簇（BGC）。突变实验证实BGC 9对RAA合成至关重要。该簇包含ras1至ras6六个基因，分别编码羟甲基戊二酰辅酶A合酶、烯酰辅酶A水合酶、天冬酰胺合酶、NAD(P)/FAD依赖的氧化还原酶、酰基辅酶A脱氢酶和Paal家族硫酯酶。敲除ras1, ras3, ras4, ras6完全 abolishes了RAA的产生，而ras2和ras5具有部分冗余功能，双敲除则完全阻断合成。
RAA的生物合成分为两步，RAB是其中间体
在分离过程中还鉴定到另一个化合物RejuAgro B (RAB)，其结构类似于两个RAA分子的对称连接，但缺乏RAA的硫甲基（-SCH3）。RAB本身无抗菌活性。遗传学和喂养实验表明，Ras2和Ras5参与RAB的合成，而RAB是RAA生物合成途径中的一个关键中间体。向Δras2Δras5双突变体添加外源RAB可部分恢复RAA的生产，证实了RAB作为前体的角色。
RAA对E. amylovora的抗菌机制
大分子合成抑制实验显示，在2倍MIC浓度下，RAA能同时显著抑制E. amylovora的DNA、RNA和蛋白质的合成，其多靶点抑制模式与常规抗生素（如四环素、环丙沙星、利福平）的单一靶点抑制截然不同。同时，RAA表现出快速的杀菌活性。谷胱甘肽（GSH）保护实验发现，添加GSH能剂量依赖性地减轻RAA的抗菌作用，而GSH对其他常规抗生素无此保护效果，提示RAA的活性可能与硫醇反应性有关。二维主成分分析（PCA）进一步确认，RAA在化学空间上与传统抗生素类别显著区分，占据独特位置。
研究结论与意义
该研究系统性地发现并表征了源自Pseudomonas soli的新型抗菌剂RejuAgro A (RAA)。RAA在防治梨火疫病方面展现出巨大应用潜力：其对E. amylovora（包括链霉素抗性菌株）的室内抗菌活性与链霉素相当；在跨美国东西部多种气候和品种的多年田间试验中，较低剂量（20-30 ppm）的RAA即能达到甚至优于标准剂量（100 ppm）链霉素的防病效果，证明了其田间实用性和稳定性。更为突出的是，RAA具备广谱抗菌活性，对多种植物病原细菌和真菌均有效，这大大扩展了其潜在应用范围。
研究深入揭示了RAA的作用机制，其通过同时抑制DNA、RNA和蛋白质合成实现多靶点杀菌，且其活性可被谷胱甘肽逆转，提示其作用可能与硫醇反应性相关。这种独特的作用模式使其在化学空间上与传统抗生素区分开来，可能降低了与传统抗生素产生交叉耐药性的风险。此外，研究还成功鉴定了负责RAA生物合成的基因簇（ras1-ras6），并初步阐释了以RAB为中间体的两步生物合成途径，为未来通过合成生物学手段优化产量奠定了基础。
这项研究的发现具有重要科学意义和应用价值。首先，RAA为应对梨火疫病防治中的抗生素耐药性危机提供了一个高效、可靠的替代方案。其次，由于其独特的作用机制和广谱活性，RAA有潜力发展成为一款多用途的植物病害防控药剂，减少农业生产中对特定单一药剂的依赖。再者，RAA较小的分子量、较高的脂水分配系数（log Kow）和适宜的pKa值，预示其可能具有良好的植物组织渗透和转运能力，这或许是其田间表现优异的原因之一。最后，该研究也为从环境微生物中挖掘新型活性天然产物以应对农业和医学领域的耐药性挑战提供了成功范例。总之，RAA的发现标志着植物病害防控领域的一个重要进展，为发展可持续、环境友好的农业实践，以及保护人类医用抗生素的有效性贡献了新的解决方案。
