《Antioxidants》：Dimercaprol Reprograms Intestinal Redox Homeostasis and Organelle Crosstalk to Combat Iron-Induced Gut Dysbiosis Through NRF2/HO-1 Signaling
Asad Khan,
Zongliang Xiong,
Iftikhar Ali Khan,
Xiangyu Cheng,
Qihui Luo,
Lanlan Jia,
Wentao Liu,
Chao Huang and
Zhengli Chen
编辑推荐：
本文研究了药物二巯基丙醇（DP）对抗慢性铁过载所致肠道损伤的潜力。铁过载可诱导氧化应激、铁死亡（Ferroptosis）、破坏紧密连接、引发内质网应激（ER stress）及线粒体损伤，导致肠道菌群（Gut Microbiota）失调。研究发现，DP能有效激活NRF2/HO-1（Heme Oxygenase-1）信号通路，从而增强细胞抗氧化防御、恢复细胞器间（如线粒体与内质网）的正常互作、重塑肠道菌群与代谢稳态，为治疗铁过载相关肠道疾病提供了新的策略。
引言：铁、氧化应激与肠道稳态的复杂纠葛
铁作为一种必需的微量元素，在氧运输、能量合成及抗氧化防御等多种生理过程中发挥关键作用。然而，铁平衡一旦被打破，无论是缺乏还是过量，都会对健康造成损害，尤其以过量铁的危害在胃肠道领域备受关注。过量铁可引发一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式——铁死亡（Ferroptosis）。在肠道中，铁过载会诱导强烈的氧化应激（Oxidative Stress）和炎症反应，破坏肠道上皮屏障的完整性，导致肠道菌群（Gut Microbiota）组成发生紊乱，即菌群失调（Dysbiosis）。这种状态与内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress）、线粒体功能障碍等细胞器异常紧密关联，共同构成了一系列肠道疾病的病理基础。目前，针对铁过载诱导的肠道损伤，尤其是涉及铁死亡机制的治疗策略，仍然非常有限。因此，寻找能够有效干预这一过程的治疗化合物，是当前研究的重要目标。本研究所关注的二巯基丙醇（Dimercaprol, DP），是一种已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物，因其抗氧化和细胞保护潜力而受到关注，但其在铁死亡相关肠道损伤中的作用机制尚不明确。
材料与方法：从动物模型到细胞水平的系统性探究
为了系统评估DP的疗效与机制，研究团队在体内和体外建立了铁过载模型。在体内实验中，研究人员通过对C57BL/6小鼠连续16周灌胃柠檬酸铁（Ferric Citrate, FC, 286 mg/kg BW），成功构建了慢性铁过载小鼠模型。随后，将FC模型小鼠分为两组，一组作为阳性对照（FC组），另一组则通过腹腔注射进行为期4周的DP治疗（10 mg/kg）。在此期间，研究者对小鼠进行了包括蔗糖偏好实验、胃肠道总转运时间、结肠动力（以玻璃珠排出时间评估）在内的多项行为学与胃肠功能测试，并定期监测体重和摄食量。在实验终点，收集了小鼠的结肠组织和结肠内容物，用于后续分析。
在体外实验中，研究选用了猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）作为研究对象。细胞首先暴露于50 μM的FC中处理24小时，以模拟铁过载损伤，随后再使用不同浓度（0, 25, 50, 100, 200 μM）的DP处理6小时，通过CCK-8法检测细胞活力以确定DP的最适保护浓度。为了深入探究机制，研究还利用了RNA干扰技术，通过转染NRF2特异性小干扰RNA（siRNA）来敲低IPEC-J2细胞中的NRF2基因表达，以验证DP的作用是否依赖于该通路。
分析手段涵盖了多个层面：通过16S rRNA基因测序和基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的非靶向代谢组学，分别评估了结肠菌群结构和代谢产物的变化；通过组织病理学染色（H&E, AB-PAS）、免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF），观察了结肠组织的形态学变化及特定蛋白的定位与表达；通过透射电子显微镜（TEM），直观地分析了线粒体、内质网等细胞器的超微结构；通过蛋白质印迹（Western Blot）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA），检测了多种关键蛋白和基因的表达水平；还检测了一系列氧化与抗氧化指标，如活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH/GSSG）比例等，以评估细胞的氧化还原状态。
结果：DP如何多维度发挥肠道保护作用
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重启细胞保护盾：激活NRF2/HO-1通路
研究证实，长期FC暴露会损害肠道细胞中关键的细胞保护性抗氧化防御系统——NRF2/HO-1信号通路。而DP治疗能够有效地恢复该通路的功能。在体内，DP处理上调了小鼠结肠组织中NRF2、HO-1及其下游与线粒体生物合成相关的PGC-1α的蛋白和mRNA表达水平。在体外IPEC-J2细胞中，DP在50-100 μM浓度下能最有效地逆转FC导致的细胞活力下降，并将细胞活力提升至接近FC对照组的近三倍。Western Blot和免疫荧光结果一致显示，DP处理显著增加了IPEC-J2细胞中NRF2和HO-1的蛋白水平。有趣的是，即使在敲低NRF2的细胞中，DP仍能诱导HO-1和PGC-1α的表达，提示DP可能还存在不依赖于NRF2的HO-1诱导机制。
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对抗氧化风暴：增强抗氧化防御，降低氧化损伤
DP的抗氧化效应明确依赖于NRF2通路。研究表明，DP处理能显著降低FC引起的细胞内ROS积累和脂质过氧化产物MDA的含量，并降低另一氧化损伤标志物4-羟基壬烯醛（4-HNE）的蛋白水平。同时，DP能上调重要的抗氧化酶——谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的蛋白表达。这些有益效应在敲低NRF2后均被取消。此外，DP还改善了细胞的整体抗氧化状态，提高了结肠组织和细胞中GSH/GSSG、NADPH/NADP+的比值，并增强了SOD、过氧化氢酶（Catalase）的活性和总抗氧化能力（T-AOC）。
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修复细胞“发电站”与“蛋白质工厂”：恢复线粒体-内质网交互与功能
透射电镜结果提供了直观证据：FC暴露导致小鼠结肠上皮细胞的线粒体肿胀、空泡化，内质网扩张，微绒毛丢失，且线粒体与内质网之间的空间距离异常接近。DP治疗有效地逆转了这些超微结构损伤，恢复了正常的细胞器形态和数量。免疫荧光和Western Blot分析进一步证实，DP能恢复线粒体外膜转位酶（TOM20）的蛋白表达和定位，并降低内质网应激关键分子伴侣GRP78的表达及其与TOM20的共定位。这表明DP恢复了因FC破坏的线粒体与内质网之间的正常生理性互作（Crosstalk）。在IPEC-J2细胞中，DP对TOM20的恢复作用同样依赖于NRF2，因为敲低NRF2会消除这一效应。
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加固肠道“城墙”：保护屏障完整性并抑制炎症
肠道屏障的完整性对健康至关重要。研究发现，FC暴露会破坏IPEC-J2细胞间的紧密连接，导致关键连接蛋白如ZO-1的蛋白降解和定位紊乱，细胞边界变得模糊。DP治疗显著恢复了ZO-1和闭合蛋白（Claudin-1）的蛋白及mRNA表达，并部分恢复了 Occludin 的表达趋势，从而重建了清晰的细胞边界和屏障功能。与屏障损伤伴随的是细胞损伤和炎症。DP处理显著降低了FC引起的乳酸脱氢酶（LDH）释放和线粒体细胞色素c（Cytochrome c）的泄漏，表明其减轻了细胞膜损伤和线粒体外膜透化。在炎症方面，DP能显著降低FC诱导的促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）的蛋白水平，并下调IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达趋势。
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缓解“细胞压力”：通过NRF2/HO-1通路减轻内质网应激
深入的机制探索发现，FC暴露会同时引发线粒体功能障碍和内质网应激（ERS），表现为内质网应激关键标志物——激活转录因子4（ATF4）、ATF6、C/EBP同源蛋白（CHOP）、GRP78以及X盒结合蛋白1剪接体（XBP1s）的蛋白和mRNA水平显著升高。DP治疗能够有效降低这些内质网应激标志物的表达。然而，当敲低NRF2后，DP对内质网应激的缓解作用被取消，并且这些应激标志物的表达反而进一步升高。这清楚地证明，DP通过激活NRF2/HO-1通路来抑制FC诱导的内质网应激，该保护作用严格依赖于NRF2。
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重塑体内“微观世界”：纠正菌群失调与代谢紊乱
对结肠内容物的分析揭示了DP在整体层面对宿主的影响。非靶向代谢组学分析发现，FC暴露改变了结肠的代谢谱，其中一些与铁死亡相关的代谢物如7α, 12α-二羟基-5β-胆甾烷-3-酮、11(R)-HPETE等水平升高，而一些有益代谢物如5-戊酸、吲哚、烟酰胺等水平降低。DP治疗能够使这些紊乱的代谢物水平趋向正常化。16S rRNA测序结果显示，FC导致了肠道菌群结构的显著失调，表现为有害菌科如肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）和拟杆菌科（Bacteroidaceae）的丰度增加，在属水平上，大肠杆菌（Escherichia）、艰难梭菌（Clostridioides）和粪杆菌（Faecalibaculum）等机会致病菌富集。DP治疗有效地逆转了这种菌群失调，抑制了这些有害菌的过度增殖，并使菌群整体结构向健康对照组（PBS）状态恢复。组织病理学染色也证实，DP治疗减轻了FC引起的结肠组织损伤，改善了组织结构完整性和杯状细胞数量。
讨论与结论：DP——一种通过NRF2/HO-1通路对抗铁过载肠损伤的潜在多效性治疗剂
本研究系统阐明了二巯基丙醇（DP）在对抗慢性铁过载所致肠道损伤中的多维度保护作用及其核心分子机制。铁过载通过诱导氧化应激和铁死亡，破坏肠道屏障，引发细胞器（线粒体、内质网）功能障碍及交互异常，并最终导致肠道菌群和宿主代谢稳态的紊乱。DP，凭借其巯基，能够有效地重新激活被铁过载抑制的核心细胞保护通路——NRF2/HO-1信号轴。
机制上，DP通过激活NRF2，发挥强大的抗氧化效应，提升GPX4等抗氧化酶的表达，清除ROS，抑制脂质过氧化。同时，NRF2的激活是DP恢复线粒体功能、减轻内质网应激、并重建两者间正常生理互作的关键。此外，DP还能通过依赖或不完全依赖NRF2的方式上调HO-1，进一步增强细胞保护。在功能层面，这些细胞和分子水平的改善，共同促成了肠道上皮紧密连接屏障的修复、炎症反应的减轻，并最终重塑了健康的肠道菌群组成和代谢谱。
综上所述，本研究确立了DP作为一种通过激活NRF2/HO-1通路，综合改善氧化还原稳态、细胞器功能、肠道屏障及微生物-代谢平衡的潜在治疗药物，为临床上治疗铁过载相关的肠道疾病（如某些类型的肠炎、代谢性疾病伴随的肠道并发症）提供了新的候选策略和理论依据。未来研究需进一步评估DP在更复杂人体模型中的长期安全性与疗效。
