《Antioxidants》：Redox Regulation of Megakaryocyte Differentiation and Platelet Biogenesis
Hyunmin Chung,
Eunju Shin,
Taeho Park,
Hanseul Jeong,
Haiyoung Jung,
Ok-Nam Bae and
Ji-Yoon Noh
活性氧（ROS）的双面性：从细胞毒物到关键信号分子
活性氧（ROS）长期以来被视为与癌症、心血管疾病和衰老相关的有害代谢副产物。然而，越来越多的证据表明，在生理水平下，ROS是调控细胞增殖、分化和免疫反应的关键信号分子。在负责生产血小板的巨核细胞（Megakaryocyte， MK）中，ROS发挥着复杂且背景依赖的作用，既能促进也能损害其成熟过程，具体效应取决于发育阶段和亚细胞定位。本篇综述系统总结了当前证据，阐明平衡的ROS信号传导是巨核细胞发育全过程所必需的，并深入探讨了如何通过精准调控ROS来优化体外血小板生产，以应对全球血小板短缺的挑战。
- 2.
巨核细胞生成中ROS的背景依赖性作用
2.1. ROS生物学：类型、来源与调控机制
细胞内主要的ROS包括超氧阴离子（O2•?）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）等。它们主要通过线粒体电子传递链的电子泄漏和NADPH氧化酶（NOX）等专职酶产生。在巨核细胞和血小板中，已检测到NOX1、NOX2和NOX4的表达。线粒体是ATP生产的核心，其氧化磷酸化过程伴随ROS生成。H2O2相对稳定且可扩散，通过氧化靶蛋白特异的半胱氨酸残基发挥信号功能。细胞内存在精密的抗氧化系统维持ROS稳态，例如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4）以及核因子E2相关因子2（NRF2）通路。在巨核细胞中，NRF2与血小板关键转录因子NF-E2 p45相互作用，共同调控细胞保护基因和血小板特异性基因的表达平衡。
2.2. ROS在巨核细胞发育中的促分化作用
ROS通过外在（微环境）和内在（细胞自主）途径促进巨核细胞生成。在骨髓中，存在生理性氧梯度，靠近血窦区域较高的氧张力促进了巨核细胞的成熟和血小板生成。研究表明，在白血病细胞系K562和Dami中，佛波酯（PMA）或内源性大麻素诱导的细胞内ROS积累与巨核细胞分化标志物（如CD41、CD42a）上调、核内复制（endomitosis）导致的细胞多倍化（polyploidization）及细胞增大相关。抑制NOX活性可显著减少ROS生成并削弱PMA诱导的巨核细胞特征。
在分子机制上，NOX酶，特别是p22phox依赖的NOX酶，是巨核细胞分化过程中ROS的主要来源。抑制NOX活性会损害核内复制，导致未成熟、低倍体巨核细胞积累，多倍体巨核细胞群显著减少。除了NOX依赖的胞质ROS，由血小板生成素（TPO）信号下游产生的线粒体ROS（mtROS）作为代谢信号，在巨核细胞生成晚期阶段促进粗细胞向巨核系分化。TPO结合其受体MPL后，不仅激活经典激酶通路，还会诱导造血干细胞和巨核祖细胞发生快速的代谢重编程，从糖酵解代谢转向氧化磷酸化。这一转变增加了线粒体ETC活性和mtROS生成，进而增强了体外巨核细胞分化潜能。
自然过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）配体15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2（15d-PGJ2）在增加血小板释放的同时，也提高了细胞内ROS水平。抑制血红素加氧酶-1（HO-1）可进一步放大ROS积累，增强15d-PGJ2对巨核细胞分化的促进作用。值得注意的是，终末巨核细胞成熟，特别是前血小板（proplatelet）形成，伴随着mtROS的显著增加，其作为信号介质精细调控分化过程中的氧化还原依赖通路。晚期巨核细胞生成中的线粒体重塑事件，特别是线粒体分裂，与mtROS产生增加相关，后者促进细胞骨架重组和前血小板延伸。
综上所述，ROS在巨核细胞生成中的作用存在明显的阶段特异性：NOX依赖性ROS主要在早期巨核细胞谱系定向和多倍化过程中发挥作用，而mtROS则是终末形态重组和胞质断裂（最终导致血小板释放）的生理触发因素。
2.3. 过量ROS积累对巨核细胞分化的抑制作用
过量的ROS积累会破坏线粒体稳态和氧化还原平衡，从而损害巨核细胞分化和血小板生成。在自噬缺陷的巨核细胞中，升高的ROS水平会阻断分化并导致血小板生成缺陷。有趣的是，在某些情况下，降低细胞内ROS水平反而能促进巨核细胞分化，这表明存在一种复杂的双相关系：ROS不足和过量都会对巨核细胞生成产生负面影响。
多项体外研究进一步证明，维持氧化还原平衡对于高效的巨核细胞成熟和血小板形成至关重要。在骨髓微环境中，内皮祖细胞（EPC）中过量的ROS积累会损害异基因造血干细胞移植后的巨核细胞分化。长期孤立性血小板减少症（PT）是一种常见的移植后并发症，其特征是功能失调的EPC表现出ROS水平升高、凋亡增加和血管生成活性降低。用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）治疗可恢复EPC功能，增强巨核细胞生成并改善移植物恢复。
总之，这些发现表明，生理水平的ROS是早期谱系定向所必需的，但过度的氧化应激会损害巨核细胞成熟。因此，部分降低ROS可以恢复正常分化和血小板形成，强调了在巨核细胞生成过程中进行平衡的氧化还原控制的必要性。
- 3.
调控巨核细胞命运决定的氧化还原信号通路
3.1. 巨核细胞生成中ROS作为信号介质
在巨核细胞生成过程中，细胞内ROS水平必须以阶段特异性的方式进行协调，因此不仅需要考虑总体ROS水平，还需考虑其来源、种类和信号传导机制。ROS作为信号介质，在造血粗细胞向巨核细胞谱系分化过程中发挥作用。
3.1.1. 巨核细胞中转录因子网络的氧化还原控制
胎肝来源的原代巨核细胞表现出ROS依赖的血小板基因表达调控，主要由转录因子NF-E2 p45和Nrf2协调。比较分析显示，ROS积累增加可增强血小板相关基因的表达。在巨核细胞生成过程中，NF-E2 p45的上调增加了细胞内ROS水平，进而促进血小板基因表达，同时抑制Nrf2靶基因，从而在成熟巨核细胞中维持ROS积累。相反，p45缺失的小鼠表现出严重的血小板减少症和终末巨核细胞分化受损，并伴有应激反应基因表达失调。NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NQO1）是一种参与ROS解毒的Nrf2诱导的抗氧化酶，在巨核细胞生成过程中是动态必需的。因此，NF-E2 p45和Nrf2活性之间的平衡决定了巨核细胞内的ROS水平。随着巨核细胞成熟，p45相对于Nrf2占主导地位，抑制了细胞保护基因的表达，并允许ROS积累，这是血小板基因表达和释放所必需的。
ROS诱导的巨核细胞分化进一步由转录因子FLI-1协调，它是一种ETS转录因子，直接与RUNX-1相互作用，协同激活巨核细胞特异性基因表达。RUNX-1和FLI-1之间的相互作用具有分化依赖性，并受FLI-1第10位丝氨酸去磷酸化的调控。FLI-1活性的这种磷酸化依赖性控制在终末巨核细胞成熟中起关键作用。总之，这些发现表明，ROS主要通过改变NF-E2、NRF2和FLI-1/RUNX-1之间的平衡来调节巨核细胞基因表达，从而将氧化还原状态与谱系特异性转录程序耦合起来。
3.1.2. 巨核细胞生成中ROS调控的信号通路
在分子水平上，ROS激活了多种对巨核细胞增殖和分化至关重要的氧化还原敏感信号通路。在人类造血细胞受到血小板生成素（TPO）等生长因子刺激后，细胞内ROS水平迅速升高，启动一系列下游信号事件。H2O2刺激增强了多种信号蛋白的酪氨酸磷酸化。ROS传播细胞内信号的一个关键机制是通过抑制蛋白磷酸酶，从而导致白血病细胞中PI3K/AKT通路的持续激活。同时，MEK–ERK1/2通路代表了巨核细胞分化过程中关键的ROS响应信号轴。在K562和HEL细胞中，PMA诱导的ERK激活可被ROS抑制所废除，而使用U0126或PD186141药理阻断MEK–ERK1/2信号传导会导致CD34表达增加、GPIb表达减少以及倍体分布向左偏移。这些发现突显了ERK信号在巨核细胞多倍化和成熟中的必要性。ROS还调节巨核细胞中的应激相关激酶通路。多巴胺刺激提高了细胞内ROS水平，导致p38 MAPK和c-Jun NH2末端激酶（JNK）的激活，这两者对于巨核细胞增殖和分化都至关重要。
3.1.3. 血小板生成中微管组织的氧化还原调控
成熟巨核细胞形成前血小板需要进行微管细胞骨架的广泛重塑，这为延伸和血小板释放提供了结构基础。微管蛋白作为微管的主要成分，含有多个对氧化修饰高度敏感的半胱氨酸残基。生理水平的ROS促进微管蛋白聚合和动态转换，而过量的ROS会氧化这些半胱氨酸，诱导二硫键交联，并破坏微管晶格的稳定性，导致前血小板形成缺陷。
ROS对微管动力学的影响直接延伸至前血小板的起始，这一过程由钾通道信号和线粒体功能协调。KCNN4通道在血小板生物发生开始时选择性上调，通过在巨核细胞成熟晚期促进K+外流来维持细胞内钾稳态。KCNN4活性保持了线粒体膜电位（ΔΨm）和ROS平衡；相反，抑制或敲低KCNN4会导致ROS过度积累和微管组织的严重破坏，从而阻止前血小板生长所需的对称性打破事件。显微镜分析表明，KCNN4功能障碍导致微管蛋白分布不对称和微管阵列紊乱，这种表型可通过使用叔丁基过氧化氢（TBHP）直接升高ROS来重现，证实了ROS失调在抑制微管组织中的因果作用。
除了钾稳态，钙信号与ROS并行作用，在前血小板形成过程中微调细胞骨架组织。来自细胞内储存的钙动员和通过储存操作钙进入（SOCE）通道的细胞外流入激活了下游通路，促进巨核细胞粘附、收缩性和前血小板延伸。细胞内Ca2+流与线粒体活性和ROS产生密切相关，形成了一个动态反馈环，稳定微管组织。抑制关键的Ca2+信号调节因子会破坏微管蛋白聚合并损害前血小板形成，强调了Ca2+稳态、mtROS和微管完整性之间的相互依赖。
总之，这些研究表明，氧化还原信号在巨核细胞生成过程中将离子稳态与细胞骨架重塑结合起来。通过KCNN4调节钾外流和通过SOCE通道调节钙内流的协调维持了ΔΨm和ROS平衡，从而保持了前血小板形成所需的氧化还原敏感微管细胞骨架。
3.1.4. 巨核细胞发育中基于硫氧还蛋白的氧化还原系统
硫氧还蛋白-1（TXN1）系统在维持氧化还原造血和巨核细胞生成中起着关键作用。TXN1对于成年小鼠的正常血细胞生成是必需的。硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）通过与TXN和其他氧化还原敏感蛋白相互作用，进一步调节细胞和线粒体的氧化还原平衡。TXNIP缺陷小鼠在4-5月龄时开始出现进行性血小板减少，并随年龄增长而加重。在离体巨核细胞生成过程中，TXNIP缺陷的巨核祖细胞（MKP）保持较小尺寸，并显示巨核细胞特异性标志物表达减少，表明分化受损。值得注意的是，TXNIP缺陷的MKP表现出与改变的AKT信号相关的mtROS水平降低。这种氧化还原失衡伴随着代谢向糖酵解增强和葡萄糖摄取增加以维持ATP生产的转变。转录组学分析显示，与野生型对照相比，TXNIP缺陷的MKP中差异表达基因富集了氧化应激和凋亡相关基因特征。
除了在氧化还原-代谢耦合中的作用外，TXNIP被认为是一种氧化应激传感器，将TXN氧化还原控制与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体信号联系起来。在ROS依赖性从TXN解离后，TXNIP可以结合NLRP3并促进炎症小体激活及下游IL-1β成熟。最近一项研究报告称，人参皂苷代谢物化合物K在K562（和MEG-01）细胞中促进了巨核细胞分化，同时上调了NLRP3炎症小体基因程序，这表明炎症小体调节可以与巨核细胞分化和凋亡相关的血小板释放相交汇。
总之，这些观察结果表明，TXNIP的缺失破坏了氧化还原-代谢耦合。TXNIP缺失还可能重新连接氧化还原敏感的TXNIP–NLRP3炎症小体信号，导致巨核细胞生成的年龄依赖性耗竭，以及能够响应血小板减少挑战的终末成熟巨核细胞池减少。
3.2. 来自动物模型的启示：病理生理性巨核细胞生成中的氧化还原失调
3.2.1. NOX1,2缺陷揭示血小板生成和功能的氧化还原控制
NOX同工型NOX1和NOX2在血小板氧化还原信号传导中发挥着不同且背景依赖的作用。NOX2是NOX2复合物的催化核心，以其在氧化应激和细胞内信号传导中的作用而闻名。NOX2的遗传缺陷导致慢性肉芽肿病（CGD），这是一种以ROS生成受损和免疫反应失调为特征的疾病。早期研究报告称，CGD患者的血小板表现出ROS产生、分泌和激活缺陷。相比之下，NOX1主要参与G蛋白偶联受体（GPCR）激动剂（如凝血酶和血栓烷A2）的下游，介导快速的ROS产生，从而放大血小板分泌和整合素激活。Delaney等人进一步证明，NOX2在粘附受体下游，特别是含有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）的受体（如GPVI）下游发挥主导作用，有助于在高剪切条件下的血管损伤部位形成血栓。然而，Walsh等人报告称，NOX1，而非NOX2，是GPVI依赖性ROS生成的主要来源，并且这两个同工型对于GPVI诱导的血小板聚集都不是绝对必需的。相反，NOX1和NOX2都有助于动脉剪切应力下的胶原诱导血栓形成。在此模型中，NOX1缺陷在胶原相关肽（CRP）刺激后减少了ROS和血栓烷A2的产生，导致体内血栓形成延迟，而两种模型的尾出血时间均保持正常，这表明NOX1驱动胶原依赖性血栓反应，而NOX2在机械应力下微调ROS输出。
尽管存在这些区别，但NOX2在血小板功能中的确切贡献仍不清楚。Sonkar等人表明，NOX2缺陷小鼠表现出正常的血小板聚集、分泌、粘附和动脉血栓形成，得出结论认为NOX2在很大程度上对血小板激活和血栓形成是可有可无的，氧化还原补偿可能由NOX1或线粒体氧化酶介导。一致地，Xu等人证明，NOX2激活由整合素外向内信号和剪切力驱动，增强了动脉血流下的血栓生长，同时对于生理性止血并非必需。
总之，这些发现支持了一种刺激和背景依赖模型，其中NOX1主要介导GPCR驱动的、可溶性激动剂依赖性血小板激活，而NOX2在部分冗余的情况下有助于胶原和剪切依赖性血栓信号传导。这种功能划分调和了实验模型之间的差异，并强调了受体结合和血管力学如何决定NOX同工型的利用。值得注意的是，系统性氧化应激也会影响巨核细胞生成，因为骨髓巨核细胞中应激诱导的NOX1激活会增加血小板输出——这种效应可被NOX抑制剂夹竹桃麻素逆转。
3.2.2. 衰老相关的氧化还原失衡和巨核细胞生成改变
生理性衰老与造血干细胞（HSC）中细胞内ROS水平升高相关，这是由氧化磷酸化增加、抗氧化酶表达减少和累积的氧化损伤所驱动的。在衰老过程中，造血干细胞区室的一个标志性变化是向髓系偏斜的HSC转变，同时淋巴系输出减少。在这种更广泛的髓系偏斜中，血小板/巨核细胞启动的亚群（通常在操作上定义为CD41+HSC或p-HSC）也随着年龄增长而扩增。值得注意的是，CD41+HSC会响应细胞应激源（如年龄相关的ROS升高）而增加。对TXNIP缺陷小鼠的研究揭示了将氧化还原失调与衰老期间CD41+HSC增加联系起来的过程机制。CD41+HSC表现出巨核细胞/血小板偏斜的转录程序，并倾向于加速分化。衰老期间升高的ROS水平和慢性炎症扩大了这种偏斜的HSC亚群，并通过氧化还原敏感通路（包括p38 MAPK和ERK–ETS1）加强了谱系定向。新兴证据进一步表明，衰老HSC中增加的IL-27受体α（IL27Rα）信号传导可能与氧化还原失衡协同作用，加剧髓系和巨核细胞偏斜。
3.2.3. 超氧化物歧化酶失调和年龄相关血栓风险
超氧化物歧化酶（SOD）为血小板提供了关键的抗氧化保护，血小板表达胞质SOD1和线粒体SOD2，共同限制O2•?积累。在年轻血小板中，mtROS产生保持较低水平，SOD2活性相对可有可无。相比之下，衰老血小板表现出显著升高的线粒体O2•?水平和增加的线粒体促氧化剂，同时其他抗氧化系统（包括谷胱甘肽过氧化物酶（GPx-1）、过氧还蛋白（Prdx-6）和过氧化氢酶）的活性降低。最近的研究表明，mtROS有助于年龄相关的血栓形成，并且内源性SOD2在衰老过程中保护免受血小板依赖的凝血酶生成和动脉血栓形成。用药物SOD模拟物avasopasem manganese（GC4419）治疗可降低线粒体和细胞ROS水平，抑制促凝血血小板形成，并减轻衰老小鼠的动脉血栓形成。
3.2.4. 骨髓微环境内的线粒体转移：氧化还原意义
最近的研究揭示，健康的巨核细胞可以通过连接蛋白43（Cx43）依赖的缝隙连接将线粒体转移给间充质干细胞（MSC）。这种单向的线粒体转移有助于生成具有低能量、静息表型的血小板。相比之下，MSC向巨核细胞捐赠线粒体的能力有限。使用来自条件性Cx43缺陷小鼠的MSC进行的实验表明，Cx43缝隙连接是巨核细胞向MSC进行线粒体转移所必需的。在病理情况下，如镰状细胞病，功能失调的MSC表现出Cx43表达显著减少，并且无法接受来自巨核细胞的线粒体。因此，镰状细胞病来源的巨核细胞保留了过多的线粒体，导致ROS产生增加，并转向过度激活的、促凝血血小板表型。来自线粒体转移研究的新兴证据表明，细胞间线粒体交换不仅改变了受体细胞的代谢和生物能量谱，还调节了ROS动态。
3.2.5. 巨核细胞分化中ROS的细胞器来源
细胞器的改变有助于ROS失调，从而影响造血。过氧化物酶体在自由基解毒、胆汁酸合成和长链脂肪酸分解代谢中起关键作用。在过氧化物酶体缺陷小鼠模型中，在造血干细胞和祖细胞（HSPC）及MSC中观察到ROS水平升高，同时MSC产生的干细胞因子（SCF）增加。该模型表现出扩大的HSPC、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板群体，表明氧化应激可以使造血谱系输出偏向血栓生成。
线粒体复合物II功能障碍进一步说明了细胞器ROS对造血的影响。在携带琥珀酸脱氢酶复合物亚基C（Sdhc）错义突变的小鼠中，HSC显示ROS水平增加、DNA损伤、髓系偏斜、白细胞减少、大细胞性贫血和血小板增多。由于复合物II作用于TCA循环和ETC的交汇点，其功能障碍导致琥珀酸积累和过量的mtROS产生，从而调节造血稳态。
- 4.
体外血小板生产过程中氧化还原信号的逐步调控
在现代细胞治疗生产中，氧化还原调控已成为提高分化细胞产品（包括血小板）的产量、功能性和稳定性的关键策略。从干细胞体外生产血小板是输血医学和再生应用的一种有前景的方法，但实现临床相关的产量和一致的功能质量仍然具有挑战性。由于巨核细胞生成和血小板生物发生在体内受到ROS和氧化还原信号的严格调控，氧化还原生物学为优化体外血小板生产提供了一个有用的框架。因此，调节细胞内ROS水平的培养策略，如受控氧张力和明确的抗氧化缓冲，正被越来越多地探索，以保留生理细胞功能并支持可扩展的生产。
4.1. 干细胞来源血小板生物制造的当前策略与局限性
体外巨核细胞生成和血小板生产已使用胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）和成人造血干细胞（HSC）实现。人类多能干细胞（hPSC）尤其具有吸引力，因为它们可以进行基因修饰以增强自我更新能力，并作为巨核细胞的可扩展前体细胞。一个值得注意的例子是imMKCL，它表达多西环素（DOX）诱导的c-MYC、BMI1和BCL-XL。imMKCL可以在培养中稳健扩增超过五个月，包括冷冻保存后。抑制c-MYC、BMI1和BCL-XL的表达会触发终末分化和CD42b+血小板的产生。基于此平台，开发了一种湍流可控的生物反应器，实现了临床规模的血小板生成，产量高达8升。这一进展使得首个干细胞来源血小板输注的I期临床试验（iPLAT1）成为可能。输血耐受性良好，未发生重大不良事件，尽管输注后未观察到血小板计数显著增加。
尽管取得了这些技术进步，但血小板产量和功能质量仍然不理想。每个血小板通常携带五到八个线粒体，完整的线粒体功能和适当的ΔΨm对于正常的血小板激活和反应性至关重要。此外，从脐带血（CB）来源的CD34+HSPC进行的巨核细胞生成表现出线粒体分裂和功能的动态变化，表明ROS产生和氧化还原信号在分化过程中受到严格调控。当前提高血小板产量的策略——包括基因操作、生物反应器优化和细胞系工程——可能会扰乱细胞内氧化还原状态。此外，体外氧化还原信号传导与天然骨髓微环境中的信号传导有显著不同。
